中文摘要：

诱导间充质干细胞（MSCs）定向分化为软骨细胞是软骨修复和组织工程重建中的一个关键问题。近来研究发现，作为一种广泛存在、类似于磷酸化的蛋白质翻译后修饰方式，乙酰化在软骨细胞分化和成熟过程中发挥重要作用，但对其机制尚缺乏了解。基于质谱的蛋白质组学方法是研究乙酰化修饰的重要工具。本研究将以微滴培养的小鼠间充质干细胞系C3H10T1/2作为MSCs成软骨分化的体外模型，分别采用iTRAQ标记和SILAC标记、抗体富集乙酰化肽段并结合nano LC/MS/MS的蛋白质组学方法检测去乙酰化酶抑制剂suberoylanilide hydroxamic acid（SAHA）对C3H10T1/2细胞全蛋白表达谱和乙酰化蛋白表达谱的影响，分析SAHA影响MSCs成软骨分化的分子机制，为将其应用于诱导MSCs成软骨分化提供实验基础。

结论摘要：

诱导间充质干细胞（MSCs）定向分化为软骨细胞是软骨修复和组织工程重建中的一个关键问题。近来研究发现，作为一种广泛存在、类似于磷酸化的蛋白质翻译后修饰方式，乙酰化在MSCs增殖和定向分化过程中具有重要作用，但对其作用和机制尚缺乏一致的认识和了解。本研究发现，SAHA呈剂量依赖性地抑制小鼠间充质干细胞C3H10T1/2细胞的活性（IC50=3uM）。与诱导多种肿瘤细胞凋亡并将其抑制在G2/M不同，SAHA将C3H10T1/2的细胞周期阻断在G0/G1期，但并不引起凋亡，其他种类的HDACi（TSA和MS275）也具有类似的作用。为了探讨HDACi对C3H10T1/2细胞作用的分子机制，我们采用iTRAQ标记结合在线二维液质联用的定量蛋白质组学方法，分析了TSA对C3H10T1/2蛋白表达谱的影响。在所鉴定的1817种蛋白中，409种上调，507种下调。在差异表达916种蛋白质中，57种蛋白参与了蛋白质合成的EIF2信号途径，值得注意的是这些蛋白的表达均显著下调，而参与了氧化磷酸化途径的43个蛋白中除了NDUFA4，其余表达均显著上调。为了探讨表观遗传调控机制在成软骨分化过程中的可能作用，采用微滴培养和BMP2的处理建立了C3H10T1/2体外成软骨分化的模型。通过定量蛋白质组学方法分析了成软骨分化过程中间充质干细胞核蛋白表达谱的变化，在所检测到的502种细胞核蛋白中（FDR<1%），下调的有85种。对这些下调蛋白的生物信息学分析发现，Chd4处于该网络的中心，提示该蛋白在成软骨分化过程中的中重要作用，WB验证了系列相关蛋白的表达变化，并通过siRNA干扰证实了Chd4对成软骨分化的影响。 C3H10T1/2细胞中11种HDACs的表达呈现差异性，其中HDAC2的表达量最高而HDAC9最低。SAHA对蛋白质乙酰化修饰的影响也不一致，大部分蛋白的乙酰化水平增加，但也有部分蛋白的乙酰化水平被抑制。有趣的是，SAHA的处理对成软骨分化的影响也呈现浓度和处理时间的差异。通过抗体富集乙酰化肽段并结合nano LC/MS/MS的蛋白质组学方法从1372条肽段中鉴定到了267条具有乙酰化修饰位点的肽段 （267/1372）。综上，本研究从蛋白质组学的角度首次分析了HDACi影响MSCs成软骨分化的可能分子机制，为将其应用于诱导MSCs成软骨分化提供实验基础。