中文摘要：

假单胞菌WBC-3菌株能利用4-硝基酚作为唯一的碳氮源生长，已在上个基金的资助下，阐明了该菌经对苯二酚途径降解4-硝基酚的机理，克隆了一段包括参与4-硝基酚代谢全部基因簇12.7 kb的片段。其中催化4-硝基酚初始反应的4-硝基酚单加氧酶（PnpA）、对苯二醌还原酶（PnpB）基因位于两个不同的操纵子上，而催化下游代谢途径的基因簇pnpCDEFG位于另一个操纵子上，其下游的pnpR可能编码一个LysR家族的调控蛋白。初步研究表明，PnpR可能调控参与4-硝基酚代谢的三个操纵子。目前尚无硝基酚代谢调控机理的报道，结合我们已有的硝基酚代谢机理研究的工作基础, 本研究拟通过DNase I足迹法、EMSA等方法研究调控蛋白PnpR与每个启动子的结合位点, 揭示PnpR对每个操纵子的调控机理及自调控机理，研究调控蛋白及启动子结合位点突变对调控的影响，从而首次从分子水平阐释4-硝基酚的代谢调控机理。

结论摘要：

假单胞菌WBC-3菌株能利用4-硝基酚作为唯一碳氮源生长，其降解4-硝基酚基因簇中的4-硝基酚单加氧酶（PnpA）催化4-硝基酚氧化为对苯二醌，对苯二醌还原酶（PnpB）是参与4-硝基酚代谢途径的关键酶，催化对苯二醌还原为对苯二酚。参与4-硝基酚下游代谢途径的酶包括PnpC及PnpD是对苯二酚双加氧酶的两个亚基，催化对苯二酚开环生成γ-羟基粘康酸半醛；而PnpE和PnpF分别是γ-羟基粘康酸半醛脱氢酶和马来酰乙酸还原酶，催化γ-羟基粘康酸半醛经马来酰乙酸生成β-酮己二酸，继而进入TCA循环。本研究通过基因组测序及基因敲除互补实验发现和鉴定了4-硝基酚代谢的调控蛋白PnpR. 传统的LysR-type调控蛋白一般位于所调控的基因附近，而编码芳香族化合物4-硝基酚的降解调控蛋白基因pnpR与4-硝基酚的降解降解基因簇在基因组上距离较远，属于远距离调控，这与传统的LysR-type调控蛋白有一定的不同。在诱导物4-硝基酚的作用下，基因pnpR激活所调控的基因簇转录，而且对自身的转录也是起正调控作用。调控蛋白PnpR在体外可以和启动子PpnpA, PpnpB, PpnpC, PpnpR结合形成复合物，而且PNP对PpnpAB/pnpR-PnpR复合物形成有诱导作用。调控蛋白PnpR和所调控启动子PpnpA, PpnpB, PpnpC, PpnpR的主要结合位点位于启动子转录起始位点-65位置，保守序列为GTT-N11-AAC, 将保守序列突变后，启动子DNA基本丧失了和PnpR蛋白结合的能力。通过测定启动子酶活实验也发现启动子突变后，无论经4-硝基酚诱导或无4-硝基酚诱导，启动子酶活无显著变化，进一步说明了调控结合位点的保守序列的确为GTT-N11-AAC.