中文摘要：

氧化应激诱导视网膜色素上皮（RPE)细胞功能障碍和死亡是公认的老年性黄斑变性（AMD）发生的中心事件。近年来我们系统研究了氧化应激诱导RPE 细胞死亡的分子机制，发现凋亡机制和AKT 激活均不足以完全解释此时细胞死亡或存活的机理。而自噬作为目前广受关注的另一种细胞程序性死亡形式，可能在其中起重要作用。因此本研究拟在前期工作基础上，分别以老年C57BL/6 小鼠和培养的人RPE 细胞为对象，采用电镜、免疫荧光、RT-PCR、western blot、siRNA、特异性抑制剂等技术和方法（1）观察自噬标记物在老年小鼠RPE/脉络膜层的表达；（2）建立氧化应激诱导人RPE 细胞自噬及定量检测模型；（3）研究RPE 细胞自噬与凋亡的先后顺序、相互关系、相互转换或共同调节的分子机制。以期从两型程序性细胞死亡的"交叉点"入手，为AMD机理研究及治疗提供新的靶点。

结论摘要：

氧化应激和老化引起视网膜色素上皮（RPE）细胞功能障碍和死亡在年龄相关性黄斑变性（AMD）的发病中扮演至关重要的作用。目前有较多RPE细胞氧化损伤的保护及其机制研究。PI3K/AKT/mTOR是与氧化损伤和细胞存活关系最密切的信号通路之一，AKT是多种细胞内关键的存活分子。我们前期研究中意外发现，0.4mM H2O2作用RPE细胞24小时后，虽然使p-AKT的表达增加了近两倍，但仍有近50%左右细胞凋亡。这一矛盾的现象提示我们，细胞内自我保护的机制复杂程度远超想象。氧化应激时RPE细胞可能启动某种其他的自我保护机制，也可能有某种机制导致AKT等细胞保护通路作用消失。 最近，自噬（autophagy）与AMD发病机制的研究成为新的热点。自噬指真核细胞包裹部分胞质形成自噬体，并运送到溶酶体内降解，使大分子物质得以再循环。如果自噬水平过度上调，将引起自噬性细胞死亡，也称Ⅱ型程序性细胞死亡。相应的，凋亡为Type I cell death。总体而言，自噬是细胞内一种“自食（Self-eating）”现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”现象，二者共用相似刺激因素和调节蛋白，但诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。两者间的界限尚未清楚区分，而且存在着信号交叉(cross talk)。其他实验室和我们前期研究均表明，氧化应激时RPE的死亡方式主要为凋亡。但自噬性死亡是否参与，它与凋亡的相互关系如何？ 本研究发现1）通过电镜、免疫荧光、RT-PCR、western blot等技术，发现RPE细胞氧化应激状态下，可以观察到细胞内自噬泡和自噬相关基因自噬标记物LC3-II 、Beclin、NBR1、P62表达增加，提示细胞内自噬激活。（2）通过自噬特异性阻断剂3-MA和siRNA技术阻断自噬通路关键蛋白Beclin和ATG5，可以减少氧化应激诱导的细胞凋亡，并能提高细胞活力。（3）氧化应激诱导细胞自噬和凋亡增加的同时，p-AKT表达增加，使用AKT特异性阻断剂LY294002，可以减少细胞死亡；并且减少自噬相关通路蛋白Beclin-1的表达，提示AKT/mTOR通路在RPE细胞自噬激活和存活中扮演重要角色。