中文摘要：

痢疾是由志贺氏菌引起的严重肠道传染病，在今后相当长时间内仍将是传染病防治工作中的重点。前期研究发现，双功能蛋白HtrA的功能对志贺氏菌毒力至关重要。HtrA蛋白是存在于革兰氏阴性细菌周间质中的一种丝氨酸蛋白酶，能够降解多种功能性蛋白质；并兼有分子伴侣功能，对细菌周间质中蛋白质质量的维持发挥着至关重要的作用。本项目计划以福式志贺氏菌2a 2457T株为研究对象，构建htrA基因缺失突变株，通过比较蛋白质组学的方法从全局角度考察HtrA蛋白的天然底物蛋白；利用磁珠抓捕与质谱分析相结合的方法研究志贺氏菌中能与HtrA相互作用的蛋白；使用高分辨质谱方法鉴别HtrA蛋白可能存在的翻译后修饰位点。通过上述实验，力图明确双功能蛋白HtrA可能具有的新功能，发现新的毒力相关蛋白。

结论摘要：

志贺氏菌引起的腹泻病是最常见的肠道传染病，依然是包括我国在内的多数发展中国家的重要威胁。本研究首先以福氏志贺氏菌2a 2457T株和301株为研究对象，利用λ-Red系统构建了htrA基因缺失突变株、回复株，并通过双向电泳技术对这些菌株在30℃和37℃培养下的全细胞蛋白表达谱进行了分析，共鉴定到35个差异表达蛋白。但随后进行的多次生物学重复实验结果并不稳定，暗示HtrA可能对维持基因组稳定性有重要意义。Real-time PCR实验结果证实htrA基因缺失突变株在传代培养过程中会发生更高频率的基因重组和片段丢失。因此，为保证差异表达蛋白筛选的可靠性，本研究又进一步构建了HtrA的诱导表达菌株，同时利用CRISPRi技术构建了HtrA的诱导沉默菌株，并利用比较蛋白质组学对不同菌株的全菌蛋白、周间质蛋白和外膜蛋白表达谱进行了深入分析，鉴定到22种差异表达蛋白，其中PhoN2、GlnH、PhoN1蛋白有可能是HtrA的尚未报道的底物蛋白。同时，渗透压感应蛋白OsmY、外膜蛋白OmpA和OmpX的表达量均受HtrA影响，提示细菌的外膜通透性发生了改变。随后对野生株和htrA基因缺失突变株外膜囊泡进行的提取定量、电镜观察、组成分析显示，二者分泌的外膜囊泡彼此间差异很大，验证了前述HtrA影响细菌外膜稳定的推论。在HtrA相互作用蛋白的筛选鉴定方面，由于HtrA蛋白具有蛋白酶活性，过表达时存在严重的自降解现象，为了抑制其降解，我们构建了酶活位点突变株进行分析；同时采用两种不同的标签分别标记HtrA蛋白的N端和C端，结果共捕获到4种相互作用蛋白AhpC、SucC、EF-Tu及Fur。在HtrA潜在翻译后修饰形式及位点的分析方面，本研究采用高精度LC-MS/MS技术检测了三种不同酶对HtrA酶切消化后的肽段覆盖率，最终将翻译后修饰可能存在的范围缩小至83-89位氨基酸区段。随后，我们采用丙氨酸扫描的方法对可能存在修饰的氨基酸位点C、Q、E、S逐个进行了点突变，得到了四株突变株。但双向电泳结果未观察到明显的单点形式出现，仍不能确认翻译后修饰的形式及位点。总之，本研究分离和鉴定了多种HtrA潜在底物蛋白和相互作用蛋白，证明HtrA蛋白在维持细菌基因组和外膜的稳态中发挥了重要作用。此外，考虑到外膜囊泡研究是疫苗研发中的热点，HtrA蛋白缺失株在未来的疫苗生产中有潜在应用价值。