中文摘要：

白血病干细胞（leuekemia stem cells, LSC）是存在于病人体内一群微量并能引起白血病耐药和复发的细胞群，彻底清除LSC是根治白血病的关键。本组前期研究发现自制新单抗ZCH-6-3A4能有效识别和靶向杀伤髓系白血病干细胞及子代白血病细胞。抗体人源化基因改造是研究抗体药物的必要前提。本研究拟采用一系列分子生物学、全表达基因RNA转录组学和NOD/SCID动物模型等体内外实验技术对该抗体的可变区基因进行克隆、重组并进行人源化改造研究，构建人鼠嵌合型抗体Hm3A4和CDR植入型人源化抗体Hu3A4真核表达载体pHMCH3-Hm3A4和pHuCH3-Hu3A4,并分别转染至中华仓鼠卵巢细胞（CHO）中进行大量表达，对两种不同人源化程度工程抗体的生物学特性及靶向杀伤LSC及子代白血病的机制进行深入研究，为进一步研究该抗体药物奠定坚实的基础，具十分重要的科学意义和潜在的临床应用前景。

结论摘要：

白血病干细胞（leukemia stem cell, LSC）是白血病耐药和复发的根源。靶向LSC的治疗策略是当前白血病治疗研究的热点。本研究通过一系列分子生物学技术对自制CD45RA新克隆3A4抗体基因进行人源化改造。结果发现，人鼠嵌合型3A4抗体HmscFv3A4-Fc基因也称Hm3A4基因能通过自制真核表达载体pHMCH3成功转染CHO细胞并建株（Hm3A4-CHO），所分泌的抗体能有效识别98%以上的3A4阳性KG1a细胞，亲和力常数Ka=1011M-1，抗体阻滞试验证明Hm3A4能识别与亲本鼠源性抗体3A4相同的抗原表位。SDS－PAGE电泳和Western blot分析显示Hm3A4的分子量为100kDa。杀伤功能实验证实Hm3A4具有良好的ADCC和CDC作用，在无血清培养条件下Hm3A4-CHO细胞所分泌的抗体量约为2.5μg/ml。进一步人源化改造研究发现，来源于3A4的CDR区直接植入人IgG1 Fab框架模板中被证明无生物学活性。因此，通过EGFP引入scFv3A4通过真核表达载体在CHO中的表达能快速（每轮筛选仅需18小时）筛选到功能良好的人源化抗体。结果表明，在3A4抗体CDR区植入人IgG1 Fab框架区后，对编码轻链和重链各7个氨基酸残基的基因进行回复突变的基因改造能有效保持人源化3A4抗体包括HuscFv3A4-Fc和完整IgG1型人源化3A4抗体Hu3A4的生物学活性，两种高度人源化（人源化程度93.93%）3A4抗体即Hu3A4（完整IgG1人源化抗体）和HuscFv3A4-Fc融合抗体蛋白基因能成功转染CHO细胞，并能稳定分泌目的抗体而建株，流式细胞术证实两种人源化抗体均能识别97％以上的KG1a细胞，两者的亲和力常数分别为Ka=3.7×1010M-1和Ka=4.7×109M-1。抗体阻滞试验证实它们所识别的抗原表位与亲本鼠源性3A4抗体相同。SDS－PAGE和Western－blot实验证明它们的分子量分别为160kDa和100kDa,具有良好的ADCC作用，但丧失CDC功能。动物模型治疗试验证明，Hu3A4和HuscFv3A4-Fc能有效延长模型鼠（平均105天）寿命，平均成活时间分别为250天和165天（P均<0.05）。结论3A4抗体成功人源化，为该抗体进一步开发用于临床白血病治疗试验奠定了坚实的基础。