中文摘要：

N-乙基马来酰亚胺敏感因子连接物复合体(Soluble N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptors，SNAREs)在植物中具有非常重要的生物学功能。目前有关橡胶树SNAREs的研究很少见报道。本项目前期研究获得一个橡胶树新基因hbYKt，该基因编码蛋白N端具有长Longin保守区和v-SNARE保守区，羧基端有一个异戊烯基结合位点，推测是一种特殊的SNARE；此外，Northern杂交结果初步表明hbYKt与橡胶树乳管系统存在密切关系，可能在胶乳再生过程中起到很重要的作用。在此基础上，本项目拟采用转基因功能分析等方法对hbYKt进行更深入的生物学功能研究，揭示hbYKt 与胶乳再生之间的关系，从一个新的角度进行橡胶树产胶排胶的分子机理研究，为橡胶树高产育种研究提供新的重要理论基础。

结论摘要：

SNAREs(soluble-N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein attachment protein receptor,可溶性N-乙基马来亚酰胺敏感因子附着蛋白的受体)在生物中具有非常重要的功能，但SNAREs在植物中研究不多，主要集中在Q-SNARE研究，对R-SNAREs研究很少，分子机制也不清楚。有关橡胶树SNAREs研究仅见本项目组。本研究前期在筛选胶乳特异表达cDNA文库时，发现了一些与囊泡运输相关基因（如SNARE基因片段），推测有可能与产排胶相关，由此，我们对SNARE基因进行更深入的研究。本研究完成了项目预期计划目标。至今为止，本项目发表了3篇文章（1篇SCI文章，2篇中文核心期刊文章），获得了橡胶树SNARE基因-hbYKt，进行了基因序列分析和表达分析，亚细胞定位，原核表达载体构建和蛋白表达，构建了植物表达载体并转化烟草，获得了正反义转基因植株，初步了解了橡胶树SNARE的功能，推测hbYKt 属胶乳特异表达基因，可能与产排胶有关。研究结果如下（1）采用CTAB-LiCl预处理，TR IZOL后处理的组合方式，发展了一种橡胶树茎叶RNA提取新方法。克隆了橡胶树SNARE基因-hbYKt（Genbank accession number KP676147），编码蛋白分子量22.466kD，等电点7.833，N端具有Longin和 v-SNARE 保守区，属于一种特殊的Longins，归类于R-SNAREs。该基因不含跨膜区，但羧基端有异戊烯基结合位点，可以将其锚定在目标膜上。（2）该基因在常割树中表达比未开割树强，在胶乳中表达比叶子中强，在胶乳排胶过程中表达量一致，说明hbYKt 属胶乳特异表达基因，可能与产排胶有关。（3）洋葱表皮细胞和本生烟表皮细胞定位显示该基因主要定位在细胞膜上。（4）构建了原核表达载体pGEX-4T-1- hbYKt，获得了GST-hbYKt融合蛋白。（5）构建了正反义表达载体pCAMBIA1304-hbYKt和pBI121-hbYKt，转化烟草，获得了转基因烟草植株，目前转基因植株和未转基因对照植株在表型上差异不明显。hbYKt基因克隆和初步功能分析为橡胶树产排胶的分子机理研究提供了一个新基因来源。此外，为橡胶树分子生物学研究提供了一种新的RNA提取方法。