中文摘要：

苯丙氨酸解氨酶（PAL）和查尔酮合成酶（CHS）是银杏叶黄酮合成途径中的两个关键酶。本研究在已克隆银杏叶黄酮合成途径中两个关键基因GbPAL1 和GbCHS2 的基础之上，用基因组步移技术克隆这两个基因的启动子，分别将两个基因的启动子包含的顺式作用元件构建到缺失35S 启动子的植物表达载体pBI121 上，采用农杆菌介导法转入烟草中，基于转基因植株的GUS 表达和活性，分析这些顺式作用元件在调控基因时空表达中的作用，及其受低温、乙烯利、营养、干旱、机械损伤和反式肉桂酸诱导表达的特异性，以期弄清这些顺式作用元件调控GbPAL1、GbCHS2 基因表达的机理。该研究旨在揭示各种栽培措施调控银杏GbPAL1 和GbCHS2 基因表达进而调节银杏叶黄酮积累的分子机理，并为银杏叶黄酮合成途径中关键基因进行分子设计育种奠定基础。

结论摘要：

国家自然科学基金30971974/C1501，2009-2012年度研究安排总体上按照预先项目申请书的计划进行，完成了银杏GbCHS2和GbPAL1启动子功能序列的克隆及转基因烟草分析鉴定。 前期从银杏基因组中分别克隆了GbCHS2和GbPAL1启动子翻译起始位点上游2227 bp 和1921bp的功能序列。银杏CHS启动子能驱动GUS基因在烟草中的表达，表达具有组织特异性和时效性。在完整CHS启动子的调节下，ABA，Cu，UV-B，ETH及WOU能诱导GUS基因在烟草叶片中不同时期的表达，GA则对GUS表达有抑制作用。随着CHSP基因的5’端删除，GUS转录水平及活性明显下降。分析发现在327bp-680bp之间存在一个In-element acting元件，光诱导条件下Inr-element也能承担激活转录的功能。在CHSP3到CHSP4删减过程中，启动子的转录活性受到了显著影响，在这其中包含1个Q-element元件，该元件起到了增强转录信号的作用。转录水平下降迅速的另外1个区域是-664bp到-306bp的删减，在这个区域包含有大量密集的转录调控元件，其中CAAT-box 和TATA-box在基因转录调控中起到了至关重要的作用，而GATA-motif则有助于调节基因对光的响应。因此，这些关键部位的缺失可能是造成转录水平下降的根本原因。进一步分析发现，在最短的启动子片段中，仅有的CAAT-BOX和TATA-BOX单元难以诱导GUS基因高水平表达。 GbPAL启动子存在着多个顺式作用元件。银杏PAL的表达在很大程度上是由于它们的启动子所包含的cis-elements和相应的转录因子共同作用的结果。分析显示GbPAL启动子中存在低温（MYBAT）、水杨酸（W-box）、机械损伤（WAACCA）及紫外响应（I-box）的作用元件，这与银杏PAL 基因在逆境胁迫下的表达模式是一致的。GbPAL启动子中含有的L盒（L-box）和 P盒（P-box）可能是 UV-B 反应元件。转基因烟草研究表明，GbPAL启动子具有完整的调控转录功能，能调节 GUS 基因在烟草不同组织及时期的表达。GUS活性主要集中于靠近烟草叶脉细胞以及部分叶片区域细胞，茎段皮层、基本组织和维管束细胞，根部皮层和根毛。银杏PAL启动子调控在叶片、皮层和维管束细胞比较强。