中文摘要：

绵毛优若藜作为一种高度抗冻的常绿灌木，其抗冻基因的分离克隆对研究抗冻基因的分子克隆、抗冻蛋白的分子机理和植物抗寒基因工程都具有重要的意义。然而，植物抗冻基因由于缺乏同源性而无法直接利用"同源克隆"法进行克隆。本项目建立了绵毛优若藜抗冻基因的全新克隆途径，并同时解析了绵毛优若藜抗冻蛋白的抗冻活性特征。以常温下的绵毛优若藜叶片和嫩枝为对照组，冷胁迫诱导处理后的叶片和嫩枝为试验组，提取两者足量高质量mRNA，将其高质量反转录成cDNA后，获得绵毛优若藜冷胁迫SSH文库。将该文库的362个克隆进行双向测序，经序列处理后获得了代表性高的绵毛优若藜冷诱导EST文库。对362个克隆进行反向Northern杂交筛选，获得了56个表达具有明显差异的克隆，通过生物信息学分析发现有2个绵毛优若藜的候选抗冻基因，通过RACE技术克隆其全长cDNA后，经原核表达纯化，对获得的目的蛋白进行热滞活性检测，获得了绵毛优若藜的抗冻基因；采用差示扫描量热仪－显微系统，解析了绵毛优若藜抗冻蛋白的重结晶抑制活性特征；转基因烟草结果表明，与阴性对照（未转化烟草）相比，绵毛优若藜抗冻基因的转基因烟草植株表现出明显增强的抗寒性能。