中文摘要：

苯并(a)芘是广泛存在的环境污染物，可对基因组DNA造成损伤，导致致畸、致癌。深入解析苯并芘所诱导的DNA损伤应激网络各主要应答之间的有序发生与转换机制，有助于寻找干预或预防苯并芘致癌新策略。PCNA作为多种蛋白的功能协同因子，在启动和转换DNA损伤后细胞应激不同反应中发挥了中枢调度作用。但是，怎样的信号调控PCNA有序指导不同应答发生，目前并不清楚。为进一步了解该机制，本研究从PCNA泛素化修饰入手，采用显性负突变策略，通过建立拮抗性抑制PCNA泛素化的细胞模型，探讨PCNA泛素化在苯并芘介导的DNA损伤后，在细胞周期阻滞、细胞凋亡、DNA修复以及突变产生中的作用。进一步采用串联亲和纯化法，通过蛋白质组学技术，研究PCNA泛素化如何调控苯并芘介导PCNA与不同蛋白的相互作用。该研究有助于深入了解环境污染物苯并芘致癌机制，同时将丰富并拓展泛素化修饰调节细胞应答的认识。

结论摘要：

PCNA作为多种蛋白的功能协同因子，在启动和转换DNA损伤后细胞应激的诸多不同反应中发挥了重要的中枢调度作用。但是，怎样的信号调控PCNA有序指导不同的细胞应答过程发生，目前并不清楚。本项目主要围绕PCNA泛素化修饰在DNA损伤应答反应中主要生物学功能进行了探讨和研究。本实验研究中使用的DNA损伤药物苯并芘在体外没有活性，因此体外实验时必须用到其代谢产物反式二羟环氧苯并芘(BPDE)，该药物在国内暂时无法购买得到，导致后续实验无法进行，因此本实验将损伤药物改为顺铂。项目经过三年的研究，取得主要进展和成果如下通过显性负突变策略，建立了拮抗性抑制 PCNA 泛素化修饰的细胞模型。克隆形成和凋亡检测结果提示PCNA 泛素化修饰参与调控了顺铂诱导的细胞凋亡性死亡，封闭PCNA泛素化位点，在DNA损伤情况下，可诱导P53的异常高表达，从而提高了细胞顺铂敏感性。luciferas报告基因检测结果提示PCNA 泛素化修饰对顺铂诱导的 DNA 的损伤修复能力没有显著影响。细胞周期演进结果显示在顺铂损伤后,与对照组相比，mPCNA细胞几乎没有S期的细胞周期阻滞，提示PCNA泛素化修饰可能主要参与调控了细胞在S期的损伤应答过程。免疫共沉淀结果显示顺铂损伤后，无论是PCNA还是mPCNA都和CDK2有特异结合，但mPCNA募集的CDK2的蛋白量和PCNA相比，有明显降低。结果提示PCNA泛素化修饰可能提高了CDK2和PCNA的结合能力，促进了CDK2的调控功能。利用supF报告基因体内突变检测系统，证实PCNA泛素化修饰参与诱导DNA损伤诱发的高突变的产生。