中文摘要：

胶质母细胞瘤（gliomblastoma multiforme, GBM）是成年脑内最多见、恶性程度最高的恶性肿瘤，平均存活14个月。GBM的病理特征之一是组织坏死伴缺氧，表明缺氧与GBM密切相关。脑红蛋白是脑内新发现的血红蛋白家族成员，具有缺氧感受能力，同时又调控细胞内信号转导蛋白如G-蛋白的活性。最新研究表明脑红蛋白在GBM表达且与缺氧相关，我们在预实验中发现脑红蛋白与促癌基因Ras蛋白结合并可调控其下游的Raf和Erk活性，提示脑红蛋白是连接GBM细胞中缺氧信号与Ras/Raf/MAPK增殖信号通路的桥梁。本项目拟研究1）脑红蛋白对GBM细胞增殖、侵袭迁移的影响；2）脑红蛋白对动物体内GBM发生、侵袭的影响；3）确证氧-脑红蛋白-Ras-Raf-MAPK信号通路并确定脑红蛋白与Ras的结合位点；4）明确这一信号通路在GBM发生、发展中的作用。研究结果将为GBM的药物研发提供新靶点。

结论摘要：

胶质母细胞瘤(glioblastoma multiforme, GBM)是成年人脑内最多见、恶性程度最高的恶性肿瘤，平均存活14个月。GBM的病理特征之一是组织坏死伴缺氧，表明缺氧与GBM密切相关。脑红蛋白是脑内新发现的血红蛋白家族成员，具有缺氧感受能力，同时又调控细胞内信号转导蛋白G-蛋白活性。我们最早报道了脑红蛋白在原代培养的星形胶质细胞表达并具有缺血保护作用。本项目在已有的基础上研究脑红蛋白在GBM发生、发展过程中的作用和机制。组化结果显示脑红蛋白在Ⅰ、Ⅱ级胶质瘤病人的肿瘤组织高表达，而在Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤的肿瘤组织低表达。过表达脑红蛋白抑制GBM细胞的体外增殖、迁移和侵袭。反之，RNA干扰敲降脑红蛋白促进GBM细胞的体外增殖、迁移和侵袭。裸鼠皮下接种人源GBM细胞(LN229细胞)，过表达脑红蛋白明显抑制肿瘤的生长，而敲降脑红蛋白明显促进肿瘤的生长。因此，脑红蛋白具有抑制胶质瘤生长的作用。此外，脑红蛋白在低氧条件下仍具抑制GBM细胞增殖的功能；而定点突变改变Ngb的氧亲和力(H64A, H64L)显著改变脑红蛋白抑制胶质瘤细胞增殖的作用，这些结果提示脑红蛋白通过氧感受调控GBM细胞的增殖。在293T细胞和人源GBM细胞，采用Venus双分子荧光互补实验、能量共转移和免疫共沉淀方法证明脑红蛋白与H-Ras/H-Ras G12V、Raf-1结合，同时影响Erk的活性；这些结果表明脑红蛋白通过结合Ras、Raf调控Ras/Raf/MAPK信号通路。缺氧或突变脑红蛋白的氧结合位点明显改变脑红蛋白与H-Ras/H-Ras G12V/Raf-1的结合。因此，我们推断Ngb通过“氧-Ngb-Ras/Raf” 信号通路调控Erk的激活，进而控制GBM细胞的增殖和侵袭。在解析脑红蛋白与Ras的结合片段实验中，我们发现脑红蛋白与Ras的结合依赖于两者近乎完整的结构，不能获得两者结合的短肽。由于缺氧和Ras-Raf-MAPK信号通路对GBM的发生、发展具有及其重要的作用，明确脑红蛋白在“氧-Ngb-Ras/Raf/MAPK” 这一信号通路的作用，将为GBM的药物研发提供新思路。