中文摘要：

结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)细胞壁脂质在细菌对宿主的侵袭和致病等环节发挥关键作用。PDIM是MTB细胞壁的重要脂质成分，在细菌侵染等致病过程中发挥重要作用，但机制尚不明确。大量研究证实对宿主细胞凋亡调控是MTB致病的主要机制之一。申请者研究提示，PDIM突变后显著促进巨噬细胞凋亡，推测PDIM可能通过调控凋亡的机制发挥致病性。本研究综合运用分子克隆、薄层层析、流式细胞和基因芯片等研究手段，从索状结构表型出发筛选PDIM突变株并检测其毒力变化；流式细胞检测凋亡率，凋亡芯片筛选PDIM调控的凋亡基因；并用纯化的PDIM验证上述凋亡效应，阐明PDIM调控凋亡的分子机制；最后用斑马鱼模型研究PDIM调控的巨噬细胞凋亡对细菌和宿主的影响。本研究有助于揭示PDIM 的致病机制，加深对MTB 毒力与凋亡相互作用关系的理解，对阐明MTB致病机制具有重要意义。

结论摘要：

结核杆菌不含内毒素，也不产生外毒素和侵袭性酶类，其致病性主要和细胞壁中的脂质成分相关。PDIM (phthiocerol dimycocerosate)/PGLs (phenolic glycolipids)作为细胞壁的重要结构，在致病过程中发挥关键作用，但机制不明确。我们筛选到一个PDIMs/PGLs突变株。通过建立体内外感染模型，并利用microarray和蛋白质谱、组织形态学和超微结构等技术，我们对PDIMs和PGLs的致病机制进行了深入研究。体外发现，PDIMs和PGLs缺失不影响细菌的体外增殖，PDIMs/PGLs突变株在sauton、M7H9等培养基上生长无差异。但在成年斑马鱼实验中表现为完全减毒。血清感染及diff-quik stain观察，发现单核巨噬细胞等多种炎症细胞无显著差异。巨噬细胞感染发现PDIMs/PGLs突变株在静止巨噬细胞内增殖不受限制，但在IFN-r激活的巨噬细胞中明显被限制。另外，TUNEL染色发现 PDIMs和PGLs突变株在感染后1天有很强的TUNEL信号，而WT组很少；在感染后7天，WT感染组肉芽肿结构中有许多凋亡信号，而突变株少见。这一结果提示PDIMs和PGLs可能通过调控凋亡致病。随着斑马鱼全基因组注释的进展，基因芯片也已广泛用来研究病原菌的致病机理。因此，我们应用斑马鱼表达谱芯片在动物机体水平探讨PDIMs/PGLs的致病机制。Microaray结果发现大多数差异基因的功能集中在生物学过程，此外还有G蛋白偶联受体和信号转导等功能。差异基因通路分析表明PDIMs/PGLs影响宿主细胞粘附、细胞外基质-受体相互作用等通路，尤其是细胞粘附这一信号通路。通过基因共表达网络图，发现转化生长因子TGF-beta在野生组基因共表达网络中高表达，它属于细胞粘附蛋白，在细胞和胶原蛋白相互作用过程中发挥重要作用。目前为止，还未曾有报道应用蛋白组学方法研究PDIMs/PGLs的功能。本研究首次应用定量蛋白组学(LC-MS/MS)研究PDIMs/PGLs引起的巨噬细胞蛋白组学变化。结果发现，PDIMs/PGLs引起的差异蛋白主要参与细胞代谢、细胞粘附、物质转运、细胞结构组装、细胞周期、细胞凋亡等生物学过程。这提示我们PDIMs/PGLs影响了巨噬细胞的多种功能。这些发现为系统认识PDIMs/PGLs的致病机制提供新的线索。