中文摘要：

利用嗜热细菌进行纤维素乙醇的高温发酵，有望最大限度地降低纤维素乙醇的生产成本。目前乙醇高温发酵技术中存在的关键问题是发酵产物的最终浓度达不到生产的要求。经过对嗜热厌氧杆菌的代谢生理和分子生物学研究，我们发现乙醇途径关键酶的基因转录不仅受低浓度乙醇诱导而其受较高浓度乙醇的反馈抑制。乙醇在基因转录水平上的反馈抑制作用无疑是嗜热细菌终止乙醇发酵的一个重要因素。本项目将通过调控蛋白和调控基因的分离鉴定、基因的体外转录和体外重建，以及重组基因对细胞的转化和功能分析等方法，研究参与乙醇反馈抑制的调控信号、调控蛋白、调控基因或转录因子，以及其作用机理。本项研究的成果将在发现乙醇代谢调控作用的基础上进一步填补相关基础科学方面的空白，并且为以解除反馈抑制为目的的代谢工程提供设计模型。

结论摘要：

嗜热细菌进行纤维素乙醇的高温发酵，有望最大限度地降低纤维素乙醇的生产成本。乙醇高温发酵中的瓶颈问题是乙醇引起乙醇代谢的过早终止。以基因重组技术为基础的代谢途径工程和合成生物学能够有效地逾越自然障碍，创造生命奇迹。我们的研究揭示较大量乙醇的存在抑制了嗜热细菌关键酶基因的转录，关闭了乙醇代谢途径，在Metab Eng杂志上报道了“乙醇反馈抑制”现象，并提出乙醇调控学说。本项研究拟从分子水平上阐明乙醇浓度对乙醇发酵途径的反馈抑制作用的机制，进一步填补相关基础科学方面的空白，为以解除乙醇抑制为目的的合成生物学或代谢工程提供理论依据。本课题组发现，AdhA能够耐受氧气但是在pH高于7.2的条件下很快失活；而以往，人们在研究醇脱氢酶时习惯于应用pH 7.5－8的Tris缓冲液，使酶在制备过程中失活，以致天然酶和重组酶都得不到纯化和定性。这个发现解决了AdhA制备与分析中的难题，使酶学性质和生理功能得到解析。在模拟的生理条件下研究酶的生理功能，结果表明在乙醛或乙醇浓度相近时，AdhA催化正反应和你反应的比活性相似；但是随着乙醇浓度的升高AdhA催化乙醇到乙醛的活性也增强，而当乙醇浓度达到1 %，氧化乙醇的活性比产生乙醇的活性高40倍。我们构建穿梭载体转化T. ethanolicus，提高细胞中adhA的基因拷贝数，发现adhA与adhE基因的功能相反，后者提高乙醇产量而前者降低乙醇产量；当adhA与adhE同时多拷贝时，乙醇产量也略有降低。同时，我们与中科院天津所合作，解析了醇脱氢酶基因转录调控蛋白的晶体结构及其与DNA、NAD结合机制，并且发现该转录调控蛋白能够与NAD类似物（α-NAD+）形成稳定的结构，这可能成为一种调控发酵的新策略。本项目的研究揭示，乙醇代谢途径中的活性不稳定、功能不清的醇脱氢酶AdhA，在感应乙醇浓度和调控乙醇逆向代谢中起着关键作用。这个蛋白的纯化与生理功能鉴定结果支持了乙醇调控学说，为乙醇反馈抑制现象提供了解释，并且明确了基因修饰的重要目标。纵观国际科学研究的方向发现，我们报道的乙醇代谢关键酶AdhE正在被国外科学家用作基因源，在超嗜热古菌和细菌中构建乙醇代谢途径。因此，我们选择Thermotoga spp.作为乙醇途径代谢工程的载体菌株，着手研究其中的醛脱氢酶和功能性酶的应用，并已经取得了较好的研究成果。