中文摘要：

人胚胎干细胞(HES)有着巨大的医学应用前景，然而HES体外培养中存在动物源性污染的问题。我们采用人羊膜上皮细胞(HAEC)以及添加脐血清作为滋养层培养HES,发现与经典的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养系统相比较，HAEC在维持HES细胞的形态、生长以及多向分化能力方面皆优于MEF培养系统；HAEC还能上调HES 细胞表达Oct-4, Nanog等干细胞因子。本课题采用重亚硫酸盐处理结合MS-PCR、MS-RE-Southern blotting及ChIP等方法，研究HAEC对HES核转录因子Nanog、Oct-4甲基化修饰的调节，探索HAEC对HES增殖以及分化能力的影响机制；并建立无动物源性污染的中国人胚胎干细胞株。从而阐明①HAEC可能通过影响HES Nanog和Oct-4甲基化修饰而促进HES增殖和自我更新。②HAEC添加脐血清进行HES培养可解决动物源性污染的问题。

结论摘要：

人胚胎干细胞(HES)有着巨大的医学应用前景，然而HES体外培养中存在动物源性污染的问题，无法应用于临床治疗。我们采用人羊膜上皮细胞(HAEC)以及添加脐血清作为滋养层培养HES，发现与经典的鼠胚胎成纤维细胞(MEF)培养系统相比较，HAEC在维持HES细胞的形态、生长以及多向分化能力方面皆优于MEF培养系统；HAEC还能上调HES 细胞表达Oct-4, Nanog等干细胞因子；进一步对Oct-4和Nanog组蛋白乙酰化及组蛋白甲基化 ChIP分析结果显示，HAEC上生长的HES细胞Oct-4和 Nanog 基因组蛋白H3乙酰化水平以及H3K(精氨酸)4三甲基化水平皆高于MEF上生长的HES细胞。说明HAEC可以通过表观修饰促进HES细胞多能性的维持；Lkb1，又名STK11(serine threonine protein kinase11)，是一种丝氨酸、苏氨酸蛋白激酶，近期研究发现Lkb1可能调节干细胞稳态的关键途径。研究发现，HAEC为滋养层培养的人ES细胞缺乏LKB1转录因子的表达，而MEF培养的人ES细胞却启动LKB1的表达，并通过P21/WAF1通路进行多能性的调控，在MEF培养系统，通过降调LKB1的表达可以抑制人ES细胞的分化，促进多能性的维持；最新研究认为胚胎干细胞具有不同的多能性状态，即原始态(na？ve pluripotency)及始发态(primed pluripotency)，而始发态多能性状态可能是一种更容易进行分化的状态。我们采用人羊膜上皮细胞进行培养小鼠上胚层来源的ES细胞（EpiSC，始发态多能性），实验证明，以人羊膜上皮细胞为滋养层可以维持上胚层来源的EpiSC（即primed pluripotency)的未分化状态，在添加LIF的条件下， EpiSC可以较容易的被逆转为原始态mESCs(原始态多能性，na？ve pluripotency，提示人羊膜细胞的确能促进胚胎干细胞多能性的维持；最后，我们采用人羊膜上皮细胞为滋养层成功地建立了4株临床级别人胚胎干细胞系。与经典的HES细胞株系相比较，新建人胚胎干细胞株系高表达多能性标志的基因，而Oct4，Nanog以及Lin28转录因子则表现为较低的甲基化水平。综上所述，建立优化培养系统以及HES或iPS细胞质量评价体系，以获得均一、稳定、多能性强的细胞对于再生医学的研究具有重要的价值。