中文摘要：

研究表明，复发性自然流产（RSA）与母体对孕体的免疫排斥有关。CD4+/Foxp3+调节性T细胞（Treg）对维持母体对孕体的免疫耐受至关重要，而Foxp3基因的稳定表达是关键。目前，nTreg来源不足与iTreg Foxp3表达不稳定，使CD4+/Foxp3+Treg的来源问题成为RSA治疗上的瓶颈。文献报道，特定基因位点的表观遗传修饰可以实现Foxp3基因稳定表达，现已用于肿瘤的研究，而在RSA尚未见报道。鉴于此，本课题拟采用5AzaD、TSA对流产孕鼠外周CD4+/CD25-T细胞Foxp3基因特定位点进行表观遗传修饰，来获得表型和功能稳定的CD4+/Foxp3+Treg，然后将其过继转移至流产孕鼠体内，以恢复母体对孕体的免疫耐受，从而改善流产孕鼠的妊娠结局。其意义在于解决临床CD4+/Foxp3+ Treg的来源问题，为临床治疗RSA提供理论支撑。

结论摘要：

复发性自然流产（RSA）发病率高，病理机制尚未明确，目前，普遍认为母体免疫失衡可能是RSA发病的关键因素。课题组建立了雌性CBA /J×雄性DBA /2J小鼠自然流产模型，以雌性CBA/J×雄性Balb/c小鼠作为正常对照，采用流式细胞术分析脾脏CD4+CD25+Treg细胞的比例，通过Western blot 检测细胞内转录因子Foxp3蛋白的表达情况，并观察小鼠的胎盘吸收情况。结果证实了CD4+CD25+Treg 细胞数量及功能不足可能是复发性自然流产发生的重要因素。采用免疫磁珠两步法分离CBA /J流产孕鼠脾脏CD4+CD25- T细胞，应用TSA和5AzaD对小鼠脾脏CD4+CD25-T细胞Foxp3位点进行表观修饰，将得到的iTreg细胞体外培养后过继转输入CBA /J流产孕鼠体内，显著降低了流产发生率，且在胚胎着床早期转输效果更佳明显。研究表明在妊娠早期输注诱导型iTreg细胞有利于维持正常妊娠，有望为复发性自然流产的治疗提供新途径。 应用三色流式细胞分析技术及酶联免疫吸附法对复发性自然流产患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞、CD3+CD8-IL-17+Th17细胞及其相关的细胞因子进行检测，进一步证实Treg/Th17失衡与RSA的发生密切相关。采用免疫组织化学法与RT-PCR法对复发性自然流产患者胎盘组织中乙酰肝素酶（HPSE）、蛋白聚糖1（syndecan-1）、E-钙粘素（E-cadherin）的蛋白水平及mRNA的表达情况进行检测，结果显示复发性流产患者绒毛组织中HPSE的表达降低，导致降解细胞外基质能力下降，syndecan-1表达增高，影响胚泡植入，E-cadherin水平降低，阻碍滋养细胞的迁移与浸润，共同参与复发性流产的发生。 此外，研究组利用甲基化敏感的限制性内切酶消化法及基于Taqman探针的甲基化特异PCR技术对孕妇血浆中游离胎源性DNA进行检测，研究发现表观遗传学标记超甲基化RASSF1A基因及非甲基化SERPINB5基因具有胎儿DNA的特性，突破了胎儿性别和基因多态性的限制，扩大了临床应用范围，对早期预测妊娠特有疾病（复发性自然流产、子痫前期等）的发生及进展具有重要作用。