中文摘要：

牙胚上皮与间充质之间的"对话"是牙发育生物学研究的重点，对阐明牙发育过程的分子调控机制、完善牙组织工程三要素理论具有重要意义。EGFP-RhoA DM转基因鼠模型釉质发育受到上皮AmelX启动子调控的RhoA负性调控基因的影响，釉质表型与釉质发育不全非常相似，但间充质发育所受影响未知。本课题拟利用此转基因鼠模型，研究牙胚上皮RhoA信号通路被抑制的情况下牙本质发育、牙胚间充质Wnt及RhoA/ROCK信号通路所受的影响，并对成牙本质细胞及牙乳头细胞中Wnt-RhoA信号通路的交互对话及生物学作用进行研究，揭示上皮RhoA/ROCK信号通路通过牙上皮与间充质之间的对话对间充质组织发育及Wnt-RhoA信号通路的调控，证实EGFP-RhoA DN转基因鼠模型用于牙胚钟状早期上皮与间充质信号传递的实验可行，为下一步利用AmelX基因启动子连接其他基因负性调控单位建立转基因鼠模型做准备。

结论摘要：

本课题以野生型小鼠为对照，发现EGFP-RhoADN转基因鼠牙胚上皮中RhoADN信号传递至间充质，并抑制了牙本质的矿化及牙乳头细胞的分化，牙乳头中的经典Wnt通路受到阻滞，釉质发育出现缺陷及牙胚上皮层出现改变。 通过四个阶段的研究，基本达到本项目预期目标。在研究上皮RhoADN信号传递至间充质后对牙本质发育的影响的实验中，观察到一月龄转基因鼠磨牙牙本质小管结构与野生型有所差异，牙本质中钙的含量明显下降，说明转基因鼠牙本质矿化受到阻滞；与野生型相比，PN2的转基因小鼠磨牙牙乳头中成牙向分化相关基因的表达水平出现明显下降，在PN0-PN8的转基因鼠牙乳头中ALP的蛋白表达出现延迟，说明来自上皮的RhoADN信号确实影响了牙乳头细胞的成牙向分化。 在研究上皮RhoADN信号对牙胚间充质组织Wnt通路传递的影响的实验中，免疫组化结果显示，与野生型相比，PN0及PN3的转基因小鼠牙乳头细胞中β-catenin表达水平有所下降。Western Blot实验结果显示，与野生型相比，PN2的转基因小鼠牙乳头中Wnt3a、Wnt5a表达下调，胞核β-catenin表达下调；RT-PCR结果显示，与WT相比，PN2的转基因小鼠牙乳头中Wnt信号的靶基因Axin2的mRNA表达水平明显下降，表明转基因鼠牙乳头中Wnt/β-catenin信号通路受到抑制。 在探索转基因鼠牙胚间充质RhoA通路受上皮信号的调节以及RhoA通路下游各蛋白分子所受调控的研究中，在PN2的转基因鼠牙胚上皮中可以检测到融合蛋白EGFP-RhoA，6天后表达出现明显下降。转基因鼠磨牙中RhoA和 ROCK II的表达从P0到P6都出现上调；然而，当转基因鼠磨牙中RhoA信号受到阻滞，ROCK活性出现下调。 另外，在对转基因鼠牙釉质发育缺陷的表型及机制研究中，观察到转基因鼠釉质发育出现缺陷，包括牙釉质外观、微结构的异常及釉质层厚度、矿化程度的下降，实验结果表明其缺陷发育机制涉及釉质蛋白、蛋白酶的改变，及牙胚上皮粘附连接复合体的异常。 本研究从上皮及间充质两方面揭示RhoA信号对牙齿发育及Wnt信号的影响，为利用此模型继续研究RhoA信号对上皮细胞功能的影响提供依据，为继续体外研究成牙本质细胞及牙乳头细胞中Wnt-RhoA信号通路转导及交互对话提供了基础。