中文摘要：

阿魏酸酯酶是一类降解半纤维素之间、半纤维素与木质素之间相连的阿魏酸酯键的酶类总称，在食品、医药、造纸、饲料加工、生物合成及生物能源等领域具有广泛的应用潜力。然而，目前绝大部分阿魏酸酯酶的研究都来自真菌，因此，对细菌阿魏酸酯酶基因的克隆和功能研究亟待加强。为了从占微生物种类99%以上的未培养微生物中寻找新型细菌阿魏酸酯酶基因，申请人基于多年从事宏基因组文库的构建与功能基因筛选的基础，拟从微生物资源丰富而独特的红树林环境样品中，通过建立大片段DNA的宏基因组文库，获得具有优良特性的阿魏酸酯酶新基因，然后进行酶学性质的研究，进一步对功能独特的新型阿魏酸酯酶进行晶体结构的解析，阐明酶与底物的作用模式和催化机制，丰富阿魏酸酯酶的结构与功能数据库，研究结果有助于全面了解阿魏酸酯酶的催化机制和底物特异性机理，并为新功能酶的理性设计与改造提供正确的理论指导，具有重要的理论意义和应用前景。

结论摘要：

采用宏基因组学技术构建红树林环境样品文库，通过功能筛选，获得1个具有阿魏酸酯酶活性的克隆子（pUC118-estF27）。序列分析发现一个873bp的ORF,已提交至GenBank（HQ241478）。用pET-28a (+)在BL21 (DE3)中对蛋白进行表达，重组EstF27的最适温度和pH分别为40？C和6.8。为了提高Est27的热稳定性，通过两轮随机突变和有益突变叠加，最终获得一个含有六个突变点的突变子M6（T27I/S84L/V161I/G243C/H195L/A259V）。其最适温度为65？C，在55 ？C下的半衰期是EstF27的3,360倍（1,680 hvs 0.5 h）。采用动态光散射法测定温度对蛋白颗粒直径的影响，结果表明引起突变子M6蛋白颗粒急剧变化的温度比EstF27的高12 ？C（68 ？Cvs56 ？C）。这些结果说明突变子M6的热稳定性明显优于EstF27。同时，M6的催化效率是EstF27的1.9倍，说明这些突变在提高该酶热稳定性时没有折损其活性。为了深入了解EstF27热稳定性提高的结构基础，采用CsCl浸泡法解析了M6的晶体结构，其分辨率为2.0？，PDB登录号为4ZRS。该蛋白呈球形，为典型的α/β水解酶，在主要α螺旋和β片层中，只有β2链反平行于其他链，其余链均相互平行。结构分析和生化实验表明突变G243C使得C243与C243'形成一个新的二硫键，从而增加了蛋白的热稳定性。其他突变位点大多倾向于通过增加蛋白的疏水性来提高其热稳定性，其中几个也位于二聚体界面上。比如，T27I和接近二聚体界面的α1链上的L5、L9以及L12形成疏水相互作用；A259V增加了与来自另一亚基α10’的疏水相互作用；突变后的L195位于由Y199，F77，W206和I183形成的疏水环境中，L195的δC原子和前三个残基的芳香环之间的最近距离为3.7-3.9？；L84与F89和Y90的距离也在相似的范围内；I161也位于一个疏水口袋中，由残基L222，L215，I220，I157，I179和I174包围，其距离均小于5.0？。这些发现为H195L，S84L和V161I对热稳定性提高的贡献提供了合理的解释。通过本项目的研究，获得了一个性质优良的阿魏酸酯酶，丰富了阿魏酸酯酶结构-功能关系的知识，具有重要的理论意义和广泛的应用前景。