中文摘要：

灰飞虱传播引起的水稻条纹叶枯病在我国广大稻区爆发流行，了解灰飞虱与水稻条纹病毒（Rice stripe virus, RSV）的专化性识别和传播机制是防治该病毒病害的关键。本项目以申请者所在实验室进行多代选择纯化获得的 RSV高亲和性带毒和无毒灰飞虱群体为材料，采用酵母双杂交技术、双向电泳、Gel overlay assay、免疫共沉淀等分子生物学方法筛选灰飞虱体内与RSV病毒专化性互作的蛋白候选因子，通过相关蛋白基因的原核表达及制备的抗体、以及免疫电镜、共聚焦显微镜等实验手段明确互作因子在灰飞虱识别病毒和传播病毒过程中的作用及在灰飞虱体内的定位等功能。目前尚未见灰飞虱专化性识别和传播水稻条纹病毒相关蛋白的报道，本研究结果可望在病毒与介体互作关系方面有新的发现，并为控制昆虫传播最终防治病害提供新的理论依据和新思路。

结论摘要：

水稻条纹叶枯病是由灰飞虱传播水稻条纹病毒（RSV）引起的，该病的流行与灰飞虱的广泛发生有着密切的关系。因此，了解灰飞虱对RSV的传播机制是防治该病害的关键。为探究灰飞虱传播RSV机制，本项目从灰飞虱体内RSV特异性互作因子角度展开了研究。实验室筛选获得灰飞虱高亲和性高带毒群体，以此为材料，采用同源重组构建获得酵母双杂交cDNA文库。检测结果表明文库库容量为3.68×107 cfu，重组率大于95%，cDNA插入片段平均长度>1 kb，达到了标准cDNA文库的要求。建库完成后，以RSV-NCP为诱饵筛选文库，共获得12个互作蛋白，并克隆了部分蛋白的全长基因，分析了他们与病毒的互作能力。以高亲和性无毒灰飞虱群体为材料，采用双向电泳分离灰飞虱总蛋白，通过病毒覆盖测定从灰飞虱总蛋白中筛选出5个能与RSV粒子特异性结合的蛋白因子。对互作因子进行质谱测定，5个蛋白分别鉴定为有活性的蛋白激酶C受体、3-磷酸甘油醛脱氢酶、60S核糖体蛋白L5（RPL5）、RPL7a和RPL8。以质谱鉴定获得的肽序列标签检索灰飞虱转录组数据库，得到部分序列信息，进一步克隆了5个互作蛋白因子的基因。对5个蛋白因子进行互作功能验证，酵母双杂交实验显示，RACK和GAPDH3与RSV-NCP无互作关系，RpL5、RpL7a和RpL8与RSV-NCP存在较强的互作关系；将5个互作蛋白进行了表达，并通过表达蛋白的体外病毒结合实验分析5个互作蛋白的病毒结合能力，far-Western blot的结果与酵母双杂交一致，斑点免疫检测（DIBA）显示5个蛋白对RSV粒子均有结合能力。饲喂灰飞虱3个核糖体蛋白dsRNA，发现病毒在昆虫体内的增殖受到抑制。结论RACK和GAPDH3与病毒的互作可能依赖于蛋白在膜系统中的特殊构象，推测参与病毒的跨细胞作用；3个核糖体蛋白（RpL5、RpL7a和RpL8）可能参与RSV在灰飞虱体内的增殖。分析了RSV胁迫对mucin基因表达的影响，结果表明，病毒胁迫使灰飞虱mucin基因的表达量增加，暗示mucin基因在RSV与灰飞虱互作过程中起着重要作用。本研究结果为进一步研究灰飞虱传播RSV分子机制奠定了基础，同时为研究灰飞虱传播RBSDV分子机制提供了重要的参考和借鉴。本项目发表论文6篇，培养博士1名，硕士2名，项目组成员参加国际会议并做大会报告1次，达到了预期研究目标。