中文摘要：

人乳头瘤病毒（HPV）是无包膜双链DNA病毒，晚期表达结构蛋白L1和L2组成病毒衣壳。在适当的条件下，L1蛋白能形成五聚体（Pentamer），并由72个五聚体自组装（Self-assembly）构成类病毒颗粒(Virus-like Particles,VLPs)。因既具简单结构和复杂功能两重性，又具有在适当条件下可迅速自组装成VLPs的特点，HPV成为当前化学家和生物学家了解、认识和模拟病毒繁衍机制的有序结构及自组装体模型。本申请首次提出不同亚型HPV L1五聚体杂合自组装概念和研究思路，拟通过对L1蛋白结构的改变和折叠体形状的调控，实现由单体到五聚体、再到VLPs的多级、杂合体外可控自组装，并揭示其中相关分子机理、组装过程和动态机制。希望能从本质上揭示病毒蛋白结构、生物大分子自组装体与其功能的内在联系，为简单生物体的模拟组装开辟一条新路径，也为有效预防或制服病毒奠定理论基础。

结论摘要：

以降低预防性人乳头瘤病毒(HPV)疫苗成本、提高其稳定性和广谱性为出发点，以深入HPV揭示衣壳蛋白自组装机理和关键组装因素为目的，我们重点开展的研究如下以高危性 HPV16 L1、18 L1为例，通过基因重组互换关键肽链段构建了两重组L1蛋白； FPLC确认它们都能形成很好的五聚体（16和18 L1Bi-P），表明互换序列并不影响各自五聚体的形成。经体外调控组装后，单独的16、18L1Bi-P以及两者混合均形成了粒径在~50nm的VLPs。对组装过程的稳态光散射(SLS) 监测三体系给出了完全不同的组装机制，进一步的蔗糖梯度离心和免疫共沉淀(Co-IP)确认了两者确实存在杂合VLPs。将杂合子经特异性抗体标记的磁珠分离后，计算出其中两者的比例约是3:5。同时，电镜(TEM)和动态光散射(DLS)证明杂合子是全尺寸的VLPs。假病毒中和抗体实验结果表明纯化后的杂合VLPs具有高免疫原性，并且诱导了高滴度的中和抗体。本研究为含有多种亚型杂合VLPs的研究提供了可能，也为调控生物大分子自组装和揭示重要因素研究奠定了基础。在上述研究中发现，HPV16L1螺旋5 (h5) 中R466被偶然突变后不能再形成五聚体。基于此，我们分别对h5中的高度保守序列LGRKFL进行逐点突变。结果表明其中LGR分别突变成A后均无法再形成五聚体，说明h5中的LGR对五聚体形成必不可少，是潜在的抗病毒靶标；另外三点被突变成后都不影响五聚体的形成，但L469A的五聚体可溶性表达量明显增加，大约是其野生型16WT的2倍。另外，通过研究我们发现GST融合表达的L1蛋白能正确折叠，但由于GST的位阻效应迫使它只能以单体形式存在；经进一步酶切后的L1却可同步组装成五聚体。对该过程的SLS监测实现了对单体到五聚体的形成过程的原位监控，也为利用抗病毒制剂调控五聚体形成提供了新的监测途径。 进一步，以L1中h5为靶标，设计合成了一系列能有效地抑制L1五聚体形成的小肽类抑制剂。FPLC和CD结果表明小肽序列和构象是产生抑制的关键。经过筛选后的pep14的IC50为27.24nM。另外，高水溶性芳烃—CP5A和SC4A对L1五聚体的形成显示了明显的抑制; 其中CP5A抑制效应更强，IC50 为0.62mM。但由于两者作用靶标氨基酸的不同导致呈现了明显不同的抑制机制。这些研究为研发大环类抗病毒药物奠定了基础。