中文摘要：

螺旋神经元损伤是导致助听器和人工耳蜗疗效不佳的重要原因之一。人们已尝试利用干细胞移植技术，来替代或修复损伤的螺旋神经元。但是移植干细胞迁移至分化为神经元的效率低、数量少，而且对分化为神经元的细胞是否具有正常螺旋神经元的生物学特性缺乏具体深入的研究。我们拟在前期研究的基础上利用螺旋神经元损伤的动物模型观察声刺激对移植神经干细胞迁移、分化的影响并研究其分子机制。对bHLH、Wnt信号分子和神经营养因子的表达变化进行检测，初步鉴定参与移植干细胞定向分化的关键分子。在此基础上通过基因修饰的方法将促分化的分子转染至神经干细胞，进一步观察其对移植细胞分化的影响，并探讨移植后分化神经元的电生理学特性及轴浆转运功能。该研究可为螺旋神经元损伤后干细胞治疗奠定理论基础。

结论摘要：

本课题在制备大鼠螺旋神经元损伤模型的基础上，通过耳蜗移植GFP标记的神经干细胞,探讨在损伤环境下,移植干细胞的迁移、分化及其分子机制；并采用声刺激、基因修饰、分子转染等技术观察移植神经干细胞的影响及生物学特性。本实验室用毒毛旋花子甙(Ouabain)成功建立了螺旋神经元(SGCs)损伤的大鼠耳聋模型。Ouabain经大鼠耳蜗圆窗给药，耳蜗基底膜铺片和phalloidin 荧光染色表明，耳蜗内、外毛细胞及其他内耳细胞未受损伤，为声刺激诱导移植干细胞的分化奠定了基础。首次发现并报道经耳蜗外侧壁移植干细胞新技术从胚胎14.5天C57BL/6-GFP转基因小鼠成功分离嗅球干细胞，通过培养、nestin鉴定，将第三代用于植入。我们创新性地将GFP-干细胞，通过耳蜗底转外侧壁微侵袭注入，结果发现耳蜗外侧壁移植的干细胞可以通过基底膜到达损伤的螺旋神经节区域，并对动物听力学影响较小。我们对螺旋神经元损伤后CXCL12／CXCR4信号途径和Wnt信号途径对移植干细胞迁移、分化的作用及机制进行了较为深入的研究，我们在研究中发现，毒毛旋花子甙损伤大鼠耳蜗螺旋神经节后，其CXCL12表达上调，且表达位置更靠近骨螺旋板区，而体外培养GFP转基因小鼠嗅球神经干细胞表达CXCR4受体， CXCL12与CXCR4结合可促使耳蜗移植干细胞向螺旋神经节迁移。同时，我们还发现SGNs损伤后，螺旋神经节高表达wnt1，而NSCs中存在wnt受体和其他的胞内关键分子，两者结合激活胞内wnt信号通路可促进神经干细胞向神经元转化。我们发现耳蜗核移植干细胞后2周，给予增强声刺激，移植的干细胞向听神经根定向迁移，而不给声刺激，细胞多呈弥散性扩散；而堵塞新生鼠双侧外耳道并进行缝扎，实现气导剥夺，螺旋神经元数量减少，出现退行性变，这些结果提示声刺激可能促进移植干细胞整合到听神经通路。我们课题组利用免疫组化、免疫荧光、rtPCR、WesternBlot等方法对bHLH家族成员NeuroD、Ngn2和Math6在SGCs损伤模型中的表达变化进行检测，并分析了这些蛋白的可能作用。结果表明Ngn2和Math6参与神经细胞增值及分化，NeuroD则参与了螺旋神经节损伤修复过程。在课题进展的同时，实验中仍有部分问题需进一步研究，如移植干细胞的迁移、分化及调控机制何其生物学特性等。