中文摘要：

盐藻（Dunaliella）是一种生存于极端环境下的真核单细胞绿藻，对重金属具有很强的耐受性。本申请拟构建盐藻（D. viridis）的酵母表达文库，然后将此表达文库转化酵母重金属敏感突变体（Cd2+敏感突变体Δyap1、Cu2+ 敏感突变体Δcup1等），筛选突变表型回复的酵母转化子，通过酵母功能互补克隆盐藻耐受重金属相关基因。其次，在对所克隆基因进行序列分析的基础上，通过对其在酵母中进行功能域缺失和点突变分析、亚细胞定位研究及酵母转化子中重金属的含量测定，并结合原核表达蛋白对重金属的结合活性分析，研究所克隆基因耐受重金属的分子机理。最后，将盐藻重金属耐受基因遗传转化高等植物拟南芥和烟草等，筛选获得高耐、高积累重金属的转基因植株，应用于土壤重金属污染的植物修复。

结论摘要：

本研究利用酵母Cd2+敏感突变体Δyap1对所构建的盐藻的酵母表达cDNA文库进行功能互补筛选，得到DvCRP1和DvCRP2这两个抗Cd2+基因，且该两个基因在已有公共数据库中均没有同源序列。过表达DvCRP1或DvCRP2均能显著提高酵母对Cd2+和Cu2+的抗性，并可增加酵母中的Cd2+积累。缺失和点突变分析表明，DvCRP1和DvCRP2蛋白的抗Cd2+功能结构域分别在N端和C端，且依赖其中富含半胱氨酸的关键基序。原核表达及体外生化分析显示DvCRP1和DvCRP2蛋白可以直接结合Cd2+。荧光定位表明DvCRP1和DvCRP2在酵母细胞中定位于细胞质及一些酸性囊泡中。RT-PCR表明DvCRP1和DvCRP2在盐藻体内的转录本水平均不受Cd2+或Cu2+诱导。Southern杂交显示DvCRP1和DvCRP2在盐藻基因组中分别为单拷贝和多拷贝。在洋葱表皮细胞中的瞬时表达说明DvCRP1和DvCRP2能正常表达并定位于细胞质中。对筛选到的转DvCRP1和DvCRP2纯合拟南芥进行Cd2+胁迫，结果显示目的基因高表达的株系，其地下部分对Cd2+的积累有所提高。