中文摘要：

细胞周期素D1（Cyclin D1）是调控细胞由G0/G1期进入S期的重要因子，其过量表达与多种人类肿瘤相关。Cyclin D1降解异常所致过表达与其致癌作用的关系越来越受关注。研究表明Cyclin D1主要经SCF Fbx4/aB-crystallin泛素连接酶介导的泛素-蛋白酶体降解，该复合体中Fbx4蛋白以二聚体的形式识别并结合T286位磷酸化的Cyclin D1。目前已经发现的人类Fbx4有两个剪接变异体。我们近期发现，除已知的变异体外，肿瘤细胞中还存在多个新的Fbx4剪接突变体，初步研究证实突变体过表达能导致Cyclin D1稳定性增加。本课题将通过研究各种剪接突变体形成二聚体能力，与a-B crystalin、Skp1形成复合物并降解Cyclin D1蛋白的能力，及对细胞生长和增殖的影响，阐明Fbx4剪接变异体的功能特点及在肿瘤发生中的作用，为进一步揭示肿瘤发生机制提供线索。

结论摘要：

细胞周期素D1（cyclin D1）是细胞周期进程的正性调节因子，在多种肿瘤中过表达，但机制尚未完全阐明。Cyclin D1 的降解由泛素化酶蛋白复合体SCFFbx4αB-crystallin介导完成，其中Fbx4和αB-crystallin可特异结合待降解的靶蛋白，决定了这一复合体的靶点和特异性。已有研究表明，在部分cyclin D1高表达的肿瘤中，Fbx4蛋白水平有不同程度的下降，提示Fbx4的表达异常可能是cyclin D1过表达的重要机制。本研究旨在进一步探索Fbx4在肿瘤中的异常表达、异常剪接及其对cyclin D1降解的影响。 本研究采用实时荧光定量PCR和Western Blot方法，首次证实肝癌组织中Fbx4 的mRNA和蛋白水平均显著低于癌旁组织。采用克隆测序方法发现，人类组织中除了还有野生型Fbx4α和截短的Fbx4β外，还有Fbx4-168-245del（Fbx4γ），Fbx4-exon2del和Fbx4-exon6del（Fbx4δ），且这些剪接异构体的表达在肿瘤组织中显著高于正常组织。我们构建了各剪接异构体的表达质粒，通过分子生物学实验和细胞生物学方法研究了这些变异体的生物学功能。结果显示，在NIH3T3和肝癌细胞SK-Hep1中过表达这些变异体能显著增加细胞内cyclin D1蛋白的水平，延长cyclin D1蛋白半衰期。与此相一致，这些变异体可促进细胞在软琼脂中的集落形成及迁移能力。不同于野生型Fbx4主要分布于细胞浆中的特性，Fbx4γ、Fbx4δ和Fbx4β在细胞浆和细胞核中均有分布。上述结果提示本研究新发现的这些Fbx4剪接变异体可能具有不同于野生型Fbx4的癌基因功能。Fbx4-C24G（rs2231917）是存在于人类基因组中的单核苷酸多态性，可使Fbx4第8位氨基酸由S变为R。我们证实rs2231917是一个功能性多态，Fbx4R8可通过定位在细胞浆进而延长cyclin D1的半衰期，并稳定cyclin D1。但因在中国汉族人群中Fbx4-24G的分布频率很低，其与胃癌、食管癌和肝癌的发生风险之间并无相关性。 综上所述，本研究从蛋白质的异常降解方面阐释了肿瘤中cyclin D1过表达的机制，具有癌基因功能的Fbx4剪接异构体有望作为肿瘤治疗的新靶标。