中文摘要：

已有充分实验证据表明，糖尿病不同组织的线粒体蛋白质酪氨酸硝基化的修饰普遍增高。定位在线粒体内膜的三功能蛋白（HADHB）是脂肪酸氧化中的关键酶，其功能异常会直接影响各个组织的能量代谢，特别是心脏组织。通过四氧嘧啶诱导的大鼠糖尿病，Murad实验室已证实HADHB在心肌组织线粒体中酪氨酸硝基化修饰显著增加，而其活性降低。然而，有关HADHB酪氨酸硝基化修饰以及修饰蛋白质的酶动力学特征的研究并没有充分展开。在本项目中，我们选用db/db 小鼠糖尿病动物模型检测HADHB的酪氨酸硝基化的修饰状态及生物活性，运用质谱技术鉴定发生该修饰位点，进而利用定点突变技术，进一步确定这些位点以及对应的酶动力学改变。同时，我们将采用iNOS基因定位表达技术，试图分析细胞线粒体内高NO应力对HADHB的修饰程度。本项研究为探索糖尿病情况下线粒体蛋白质的氧化修饰状态与糖尿病心肌病的相关性提供了一条新的思路。

结论摘要：

基于糖尿病不同组织的线粒体蛋白质酪氨酸硝基化的修饰普遍增高的报道，我们对线粒体三功能蛋白β亚基（HADHB）的硝基化修饰进行了系统的研究。在本项目中，我们首先利用特异识别硝基化酪氨酸的3NT抗体，检测了糖尿病小鼠模型心脏组织线粒体蛋白质中HADHB的硝基化修饰，发现其的确发生了增高的现象，进而我们综合利用体外和体内实验，通过原核重组表达体系表达HADHB蛋白质并对其进行纯化，采用过氧亚硝酸试剂对重组HADHB蛋白质进行体外修饰，利用MicroQ-TOF等不同类型的质谱仪器，对HADHB的酪氨酸硝基化修饰位点进行了鉴定，得到三个对较低浓度的修饰剂较为敏感的硝基化修饰酪氨酸位点，进而选用db/db小鼠II型糖尿病动物模型及对照组为实验对象，通过分光光度法以长链酮脂酰辅酶A为底物，对小鼠心脏线粒体中的HADHB蛋白质的活性进行检测，发现在II型糖尿病动物模型db/db小鼠中HADHB的活性明显减低，从而判断该种修饰对HADHB的酶活性产生了明显的抑制作用。本研究为探索糖尿病情况下线粒体蛋白质的修饰状态与糖尿病心肌病的相关性提供了新的线索。