中文摘要：

大肠杆菌虽然自身蛋白分泌能力相对薄弱，但其在培养条件、生长速率以及表达效率等方面有着无可比拟的规模化制备重组蛋白的优势。近年来随着大肠杆菌胞外分泌机理的日渐明晰，改造其蛋白分泌途径、强化胞外表达亦成为制备分泌型重组蛋白的有效途径之一。本项目针对大肠杆菌中容量最大、应用最广的Sec途径介导的重组蛋白胞外表达体系，在前期工作提出的"内膜硬化"假说基础上，主要研究解除蛋白跨内膜转运限速步和跨外膜转运主要通道的天然调控机制，强化跨膜转运。此外，引入对蛋白合成及转运的量化评价体系，构建梯度蛋白合成强度文库，研究蛋白高效合成与快速分泌的协调统一，探寻重组蛋白高效胞外分泌的策略。本研究不仅对于增强大肠杆菌分泌表达能力，改善目前胞外重组蛋白产业化成本高、效率低的现状具有十分积极的意义，而且还对大肠杆菌胞外分泌机理的进一步阐明以及提高其它表达系统的分泌能力具有一定的理论价值和借鉴作用。

结论摘要：

本项目的实施按照计划进行。首先构建了分泌型表达模型蛋白的重组大肠杆菌，并从三个方面对强化重组蛋白的胞外分泌表达展开了一系列研究。一，跨外膜转运的强化对大肠杆菌中蛋白跨外膜的主动运输途径MTB进行了探索性研究，为今后尝试打破其调控机制唤醒其表达奠定了基础；敲除了一种外膜蛋白lpp基因，构建了外膜渗漏型突变株，其胞外分泌能力有了显著提高；考察了物理化学条件对外膜透性的影响，通过添加各类培养基添加剂，重组蛋白的胞外产量可提高40倍左右，并对其影响机制进行了具体分析; 二，跨内膜转运的强化通过共表达内膜转运伴侣蛋白SecA及SecM-SecA，对增强内膜转运能力进行了探索性研究；通过添加三价铁离子及硝酸根离子等高价氧化型离子研究了PMF对跨内膜分泌的影响，但效果不明显；考察了不同信号肽对重组蛋白在大肠杆菌中胞外分泌的影响，并从中选择了最优的信号肽；信号肽切割速率对重组蛋白跨内膜转运具有重要的影响，通过增加信号肽酶切割位点的数量提高了信号肽的切割速率，加速了成熟蛋白的形成和转运，增加了重组蛋白的胞外分泌量；三，蛋白合成与分泌的协调以及优化运用TIR突变技术，获得了1/10~ 4倍的合成梯度强度的重组蛋白突变体，探索了低合成强度下重组蛋白高效胞外生产的潜力。在前述工作的基础上，通过优化合成强度和分泌效率的动态平衡关系，考察了基于诱导剂浓度对合成的影响和培养条件对内外膜透性的影响两方面因素的重组蛋白的胞外分泌优化策略，并进行了3L发酵罐放大实验，采用流加发酵的方法，配合膜透性增强剂实现了重组蛋白的高效分泌。有关上述研究共发表SCI论文10篇，国内核心期刊3篇，授权发明专利4项，申请专利2项。