中文摘要：

延胡索酸酶（EC4.2.1.2），又称延胡索酸水合酶，是生物催化延胡索酸水合生成L-苹果酸的唯一酶类，在TCA循环中具有关键性的作用，工业上主要应用于L-苹果酸的生产。但是目前工业菌种存在酶活力不高，易受分泌的天门冬氨酸转氨酶干扰的难题。本项目以来自于环境宏基因组文库的新型高活性的延胡索酸酶（FumF）为研究对象，系统分析目标基因所蕴含的生物学信息，构建以"T7lac"为启动子的重组表达克隆，实现在大肠杆菌系统中的高效表达；利用Ni-NTA镍柱亲和层析等技术纯化目标蛋白；利用LC-MS技术解析酶的功能；利用酶法体外随机-定位诱变技术，构建突变酶库，比较突变酶和FumF之间的功能差异和酶学性质差异，研究相关保守氨基酸残基的突变对酶的功能影响。本项目的成功实施将为构建高效的延胡索酸酶基因工程菌提供理论依据，对解决应用中延胡索酸酶活力不高，消除天门冬氨酸转氨酶干扰的瓶颈问题提供新的选择模式。

结论摘要：

延胡索酸水合酶(EC 4.2.1.2)催化延胡索酸的水合然后生成L-苹果酸，它也是TCA循环和氨基酸代谢中一种关键的酶。来自于特殊生境的高活性和耐热性良好的延胡索酸水合酶在工业生产L-苹果酸中具有广泛的用途。本研究采集中国广西北部湾某海域海水，构建了一个宏基因组质粒文库。基于序列特异性筛选的策略分离得到了一个新型延胡索酸水合酶基因（fumF）。氨基酸序列分析揭示FumF蛋白和来自于Bacteroides sp. 2_1_33B 和 Parabacteroides distasonis ATCC 8503的延胡索酸水合酶具有26%的一致性和43%的相似性。fumF基因被克隆到pETBlue-2 载体上，在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中实现了高效表达。HPLC实验结果证实了纯化的重组FumF 蛋白可以催化延胡索酸与水的水合生成L-苹果酸。在pH 8.5 和 55℃条件下，添加 5 mM的 Mg2+，FumF 蛋白具有最大的催化活性。FumF 蛋白显示了与底物良好的亲和性和较高的催化效率在最适条件下，Km为 0.48 mM, Vmax为827 μM /min/mg, kcat/Km为1900 mM/s。DNA定点突变实验结果推测氨基酸位点A163、H170和V347对于FumF蛋白的最适作用温度和pH值以及热稳定性是必需的。利用DNA随机突变技术构建分离得到了一个可能包含延胡索酸还原酶frd1A 新基因的突变克隆pGXAR313并完成了新基因的生化功能鉴定研究。序列分析比较结果揭示可能的新的基因frd1A 和相关延胡索酸还原酶蛋白具有较近的进化关系。frd1A基因被克隆到pETBlue-2载体上并将重组DNA分子导入E. coli Tuner(DE3)pLac？感受态细胞。利用镍柱亲和层析技术完成了目标重组蛋白的分离纯化。HPLC功能鉴定研究揭示Frd1A蛋白可以催化延胡索酸还原为琥珀酸。该酶的最适pH为7.0，最佳作用温度为28 °C。 Zn2+ 和 Mg2+可以刺激酶活的提升。在最适反应条件下，Frd1A蛋白的催化表观动力学参数为 Km= 0.227 mmol/L, Vmax= 29.9 U/mg, and kcat/Km=5.44×104 per mol/s。新型延胡索酸酶基因的克隆和相关突变蛋白的鉴定研究显示了来自于环境宏基因组新蛋白的研究价值。