中文摘要：

抗坏血酸（AsA）作为植物体内重要的抗氧化剂，在线粒体中合成后通过其特异转运蛋白（AsAT）的作用才能进入胞质、叶绿体、过氧化物体、质外体等细胞区室。在前期研究的基础上，本项目以干旱胁迫下表达量显著上调的苹果3个AsAT同源基因为目标，拟通过亚细胞定位、定量PCR及免疫原位杂交等方法研究AsAT的组织细胞表达特性；分别在酵母中异源表达，研究AsAT对AsA的转运能力及特性；鉴定过量表达和干扰的苹果株系，研究AsAT表达量改变后对苹果AsA代谢的区室变化及抗逆性的影响；同时研究不同抗性苹果品种在逆境下AsA代谢的区室变化和AsAT表达量与ROS的关系。其目的是探明干旱胁迫诱导表达的这3个苹果AsAT的表达特性及与AsA区室分配的关系，了解逆境下AsAT在AsA区室分配和ROS清除中的作用。为认识AsA在细胞水平上的调控和分配机制，理解逆境下植物ROS清除与AsA的关系及抗性改良奠定理论基础。

结论摘要：

抗坏血酸（AsA）作为植物体内重要的抗氧化剂，由线粒体中合成后在特异转运蛋白的作用下才能进入胞质、叶绿体、过氧化物体和质外体等细胞区室。逆境下AsA的转运能力和细胞区室化在植物抗逆中起重要作用。为了探明苹果AsA候选转运相关蛋白NAT与AsA转运、代谢及抗逆的关系，首先结合苹果基因组对NAT基因家族进行了鉴定与分析，发现了14个候选基因，克隆获得了嘎拉苹果13个NAT全长cDNA序列，分析了其序列特性。利用转录组和蛋白质组分析了不同组织、发育阶段及干旱胁迫条件下NAT家族的表达与AsA含量及其代谢间的关系，结果发现在苹果不同组织和发育过程中AsA代谢存在显著的区室化特性。苹果叶绿体内AsA-GSH循环相关基因的表达量明显高于果实和茎尖，干旱下抗旱性强的‘秦冠’苹果叶片叶绿体APX和MDHAR的mRNA和蛋白表达水平显著上调，而NAT和PHT4.4家族基因的表达量也存在显著的组织器官特异性，特别是NAT1、NAT3、NAT7和PHT4.4明显受干旱等逆境的诱导，说明AsA的区室化与其抗逆性有着密切的关系，且AsA转运蛋白参与了这一过程的调控。通过拟南芥或烟草原生质体亚细胞定位及苹果免疫原位杂交发现，苹果NAT家族均定位于质膜。通过在酵母中异源表达发现，苹果NAT对AsA或DHA没有明显的转运活性。获得了NAT3和NAT7过量表达的番茄转基因株系，发现NAT3过量表达对番茄叶片和果实AsA含量无明显影响，而NAT7的过量表达使番茄叶片和果实中AsA含量增加了约20%。抗逆性分析表明，MdNAT3和MdNAT7过量表达对番茄抗旱性、抗盐性也无明显影响，但显著增加了番茄植株的抗病性和对强光的抗性。对嘎啦苹果进行遗传转化，获得了NAT1和NAT7过量表达及NAT7干扰的苹果转基因株系。分析发现，正常条件下NAT1和NAT7表达改变对苹果叶片AsA含量无明显影响，但过量表达能提高苹果幼苗的抗盐性，NAT7干扰降低了对紫外线的抗性。这些结果表明，苹果中NAT的主要功能与AsA积累和转运无关，它们可能转运其它物质调控植物的抗逆性。根据2015年的最新报道，在植物体内参与ASA转运的基因是PHT4.4，而不是NAT家族。为此，项目组对苹果PHT4家族进行了鉴定并正在进行功能分析。