近年来研究报道奶牛乳腺上皮细胞在感染早期发挥了重要的免疫保护作用,主要是通过TLRs介导。本课题拟采用ELISA法检测体外培养小鼠乳腺上皮细胞在LPS刺激下IL-8、TNF-α的分泌量来评价其天然免疫的功能;采用PCR技术检测小鼠乳腺上皮细胞上有TLR2/4受体;并通过TLR2/4受体拮抗剂添加,按上述方法检测IL-8、TNF-α的分泌量,采用流式细胞术或Real-Time PCR技术检测TLR2/4蛋白及其mRNA表达,证明小鼠乳腺上皮细胞天然免疫由TLR2/4介导;在此基础上,采用上述相应方法研究金英黄归汤对LPS刺激下乳腺上皮细胞IL-8、TNA-α分泌量,TLR2/4 mRNA、MyD88 mRNA的影响,从分子水平探索金英黄归汤对小鼠乳腺上皮细胞中TLR2和TLR4信号转导的影响。本研究结果将为乳腺上皮细胞的功能研究提供良好的细胞模型和中药防治奶牛乳房炎免疫机制提供理论依据。
mammary epithelial cells;Toll-like receptors 2/4;cytokines;Jin-Ying-Huang-Gui preparation;active ingredient
本项目以小鼠乳腺上皮细胞和金英黄归汤及其活性成分为研究对象,开展了金英黄归汤对小鼠乳腺上皮细胞中TLR2和TLR4信号传导影响的研究,详细考察了小鼠乳腺上皮细胞培养、天然免疫功能、细胞上是否存在TLR2和TLR4受体及其介导细胞因子分泌、金英黄归汤安全浓度、金英黄归汤对乳腺上皮细胞的天然免疫具有调节作用,TLR4介导信号转导的影响及机制。具体内容如下 优化了小鼠乳腺上皮细胞体外培养方法,并研究了其分泌细胞因子功能。发现混合酶消化法能更好地进行小鼠乳腺上皮细胞的体外培养,其在脂多糖(LPS)刺激下分泌细胞因子TNF-α和IL-8而具有一定的天然免疫能力。 检测了乳腺上皮细胞中TLR2或TLR4受体蛋白,并研究了TLR2或TLR4在LPS刺激小鼠乳腺上皮细胞中信号转导的作用。发现小鼠乳腺上皮细胞膜上确实存在TLR2和TLR4两种受体蛋白,在LPS刺激下主要是通过TLR4对LPS信号进行转导,而TLR2不对LPS信号进行转导。 测定了金英黄归汤及其三个主要活性成分在细胞上的安全浓度,并研究药物在小鼠乳腺上皮细胞的IC50值,结果显示金英黄归汤及其三个主要活性成分绿原酸、连翘苷和黄芪多糖浓度分别为0.49mg/mL、0.49 mg/mL、0.06 mg/mL和1.95mg/mL时不影响小鼠乳腺上皮细胞的生长。其中金英黄归汤、绿原酸和连翘苷IC50分别为12.25mg/mL、30.80 mg/mL和13.71 mg/mL,为下一步实验研究提供了坚实的数据。 研究了药物对细胞因子TNF-α、IL-8和IL-6分泌的影响,并研究了药物对乳腺上皮细胞TLR4和MyD88 mRNA表达和TLR4蛋白表达的影响。结果提示,金英黄归汤具有抑制细胞分泌TNF-α、IL-8和IL-6,其作用机制是降低了细胞TLR4、MyD88的mRNA表达量,以及TLR4蛋白的表达量,阻断细胞内信号转导通路。绿原酸、黄芪多糖也可抑制IL-8和TNF-α的分泌,其药理作用是可以降低细胞TLR4、MyD88的mRNA表达量,却升高TLR4的表达量。连翘苷可以降低LPS所致的TLR4表达量增加,同时能降低LPS所致的TLR4、MyD88 mRNA表达量增加,阻断细胞内信号转导通路,阐明药物的药理作用具有一定的理论意义,也为进一步展开深入研究拓展了思路。