中文摘要：

利用多通道单分子流式检测仪的超高灵敏、快速及多参数分析性能，结合特异性荧光探针及免疫分析方法，发展单个线粒体水平细胞凋亡信号转导研究新技术。线粒体是细胞凋亡的调控中心，线粒体的逐个分析可揭示因集权平均而被掩盖的个体差异，有益于线粒体异质性的考察以及亚类的表征，并且有可能发现与线粒体特异亚类相关的细胞学过程。拟对实验室自行研制的双通道单分子流式检测仪进行改进，增加一个荧光检测通道；对荧光探针标记的提纯线粒体进行快速分析，获得线粒体形态、膜电位、活性氧、凋亡相关蛋白的定量分布及参数之间的相关信息；通过荧光共振能量转移技术在单个线粒体水平检测蛋白-蛋白相互作用；抗肿瘤小分子诱导细胞凋亡，研究凋亡细胞线粒体各项参数的变化，确定触发线粒体PTP孔开放所需的凋亡蛋白数量。该方法将首次实现单个线粒体水平凋亡相关蛋白及蛋白-蛋白相互作用的定量检测，对于药物靶点的确定及肿瘤治疗等具有重要价值。

结论摘要：

线粒体在细胞凋亡信号转导中起着至关重要的中枢调控作用，以线粒体为切入点的信号转导研究，无论对于揭示细胞凋亡发生过程的分子机制，还是研究小分子化合物诱导肿瘤细胞凋亡的作用机理，均具有重要价值。与全细胞分析相比，单个线粒体水平的分析能够排除其他细胞器的干扰，揭示线粒体功能的异质性，并有助于线粒体亚类的发现。本课题通过超高灵敏流式检测技术与荧光探针特异性标记技术的有机结合，建立了单个线粒体水平细胞凋亡信号转导途径的研究平台，能够快速、灵敏、特异地对线粒体的形态、膜电位、活性氧、蛋白表达量等参数进行分析，为揭示细胞凋亡信号转导通路及研究小分子化合物诱导细胞凋亡的作用机制提供先进的实验技术方法。取得的重要进展如下 1. 研制出对纳米颗粒的散射和多个荧光参数进行同时检测的超高灵敏流式检测装置（HSFCM），散射灵敏度较传统流式细胞仪提升15,000倍，可以在单颗粒水平实现颗粒粒径和生化性状的快速统计表征和参数之间的相关分析。 2. 建立并优化了HeLa细胞线粒体的提纯方法，采用特异性荧光探针NAO和SYTO 62分别对线粒体内膜上的心磷脂和线粒体基质中的核酸进行荧光标记，在HSFCM上实现了单个线粒体的散射光、内膜荧光及核酸荧光的同时检测，成功地建立了考察线粒体结构完整性的实验方法。 3. 建立了线粒体膜蛋白和膜间隙蛋白的标记方法。利用HSFCM在单个线粒体水平实现了线粒体的散射光、外膜穿孔蛋白（porin）和膜间隙细胞色素C（cytochrome c）的同时检测，并在单个线粒体水平观测到Ca2+ 刺激所引起的细胞色素C的释放和外膜损伤。 4. 建立了线粒体表面蛋白绝对定量的检测方法。利用HSFCM对单个线粒体porin蛋白的拷贝数及其分布进行了测定，其结果与Western Blotting方法得到的平均拷贝数有较好的一致性。采用已建立的线粒体蛋白定量检测方法在单个线粒体水平考察了Bcl-2、Bax等凋亡相关蛋白的表达。 5. 采用线粒体膜电位探针Rhodamine-123对线粒体进行荧光标记，利用HSFCM在单个线粒体水平检测了不同抗癌药物刺激前后线粒体膜电位的变化，建立了通过测定线粒体膜电位来研究抗癌药物作用机理的新方法。