中文摘要：

木霉是最有价值的生物防治菌株之一，蛋白酶是其分泌的一类重要的细胞壁降解酶，参与降解病原真菌的细胞壁，但是有关蛋白酶对植物病原真菌的拮抗机理始终缺乏系统研究。木霉SMF2 是一株具有广谱拮抗特性的生防菌株，从其固体发酵物中纯化得到的胞外丝氨酸蛋白酶SprT 能够抑制多种植物病原真菌的生长。本项目拟以木霉蛋白酶SprT 为研究对象，从体外及体内两个方面研究其对植物病原真菌的拮抗机理。首先通过检测其抑菌谱和抑菌效力，研究其对真菌细胞壁的降解情况，确定蛋白酶SprT的体外拮抗特性。然后利用Northern 杂交和荧光定量PCR 等方法，检测蛋白酶SprT 在木霉SMF2 重寄生过程中的表达情况。并进一步通过对蛋白酶SprT 编码基因进行敲除及过量表达等分子生物学手段，构建木霉SMF2 的蛋白酶缺失突变体和过量表达突变体，进行盆栽生测试验，从而在分子水平上揭示蛋白酶SprT对植物病原真菌的拮抗机理。

结论摘要：

本项目主要通过蛋白酶的抑菌谱、抑菌效力等体外抑菌特性研究方法，结合蛋白酶缺失突变体构建等体内抑菌方式研究手段，揭示木霉SMF2产胞外蛋白酶SprT对植物病原真菌的拮抗机理。主要研究结果如下一是采用响应面分析方法，确定了木霉SMF2产蛋白酶的最适发酵条件。建立了阴离子交换色谱一步法获得电泳纯蛋白酶SprT样品的高效纯化制备技术，1g固体发酵物中约能得到24 mg蛋白酶纯品。二是证实蛋白酶SprT为丝氨酸蛋白酶，具有良好的耐热性，且在碱性缓冲体系内较稳定。SprT具有广泛的底物特异性。大多数的金属离子对该酶都有很好的激活作用，可以提高酶在应用过程中的催化效率。三是蛋白酶SprT具有广谱的抗菌活性，对尖孢镰刀菌、弯胞霉等多种植物病原真菌具有抑制作用，但对于大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌等致病细菌没有抑制作用。蛋白酶SprT可以抑制尖孢镰刀菌的菌丝生长和孢子萌发。对该病原菌的抑菌圈直径为2.5±0.3cm，作用8小时后对该菌孢子萌发的抑制率达到50%。四是蛋白酶SprT主要作用于真菌的菌丝部位。扫描电镜观察，经蛋白酶处理后，菌丝体表面出现裂痕。这可能是由于蛋白酶SprT降解菌丝体细胞壁中的蛋白质成分，破坏其完整性，从而形成表面裂痕。五是克隆了蛋白酶SprT的全长编码基因。同源性分析表明，蛋白酶SprT与来自于木霉的蛋白酶的同源性很低，其中最高的是Trichoderma harzianum产的碱性丝氨酸蛋白酶Prb1，但同源性仅为40%，说明SprT不同于已经报道的木霉丝氨酸蛋白酶，是来自于木霉属的一个新的丝氨酸蛋白酶。六是通过同源重组原理，PEG-CaCl2法介导转化，建立了SMF2高效遗传转化平台。构建了丝氨酸蛋白酶SprT基因敲除载体，获得丝氨酸蛋白酶SprT缺失突变体ΔSprT40-2。通定量PCR和活性SDS-PAGE分析表明，突变子ΔSprT40-2不产蛋白酶SprT。缺失SprT的木霉粗提液蛋白酶酶活明显下降，但是对于病原真菌仍然具有抑菌活性，抑菌效果并没有显著降低。此外，丝氨酸蛋白酶SprT的缺失不影响木霉SMF2的生长和菌落形态，对菌株SMF2和土壤病原真菌拮抗也基本没有影响。这可能与SMF2野生型菌株可以产生多种胞外水解酶及Peptaibol等抗菌肽类物质有关。在项目执行过程中，获得授权国家发明专利3项，发表论文9篇，其中SCI收录2篇。