中文摘要：

抗菌肽除了具有抗菌活性外，尚有拮抗内毒素(LPS)能力。然而目前从两栖动物中提取的抗菌肽，主要以抑菌为目的进行分离。本项目拟从中华大蟾蜍皮肤分泌物中分离出拮抗LPS活性优良的抗菌肽，并明确其拮抗内毒素构效关系。据此，我们将采用强免疫刺激物-LPS刺激中华大蟾蜍后，收集其皮肤分泌物，通过凝胶色谱、高效液相色谱分离技术，结合鲎试剂法测定，筛选出能拮抗LPS活性优良的抗菌肽。并以此为基础，通过小鼠巨噬细胞LPS刺激实验和小鼠内毒素休克模型实验，进一步确定抗菌肽拮抗LPS的能力。最后通过分析抗菌肽与LPS反应动力学参数、抗菌肽与LPS结合的三维结构以及LPS与抗菌肽二级结构的结合状态，明确抗菌肽拮抗LPS的构效关系，探讨抗菌肽组成、结构对拮抗LPS活性的影响，为抗菌肽拮抗LPS的研究奠定基础。

结论摘要：

为了高效分离中华大蟾蜍皮肤中抗菌肽，本项目运用转录组和多肽分离相结合技术，确定抗菌肽种类与序列。通过项目实施，完成中华大蟾蜍皮肤转录组深度测序，获得大约4.65G数据，通过组装和拼接，得到75229个unigenes。通过BLASTX比对，在NR数据库中，31271个unigenes标注 (占41.6%)；在NT数据库中，26170个unigenes标注 (占34.8%)；在Swiss-Prot数据库中，28079个unigenes标注 (占37.3%)；在KEGG数据库中，22943个unigenes标注 (占30.5%)；在COG数据库中， 9658个unigenes标注 (占12.8%)；在GO数据库中， 20814个unigenes标注 (占27.7%)。在中华大蟾蜍转录组测序的基础上，结合生物信息学手段，发现2个Cathelicidin抗菌肽家族基因，并预测出6个抗菌肽序列。在抑菌试验中，BG-CATH（5-37）对嗜水单胞菌效果最明显(MIC=12.5ug/ml) 。小鼠巨噬细胞RAW 264.7 LPS刺激实验中，BG-LW18可以降低IL-6水平，BG-CATH(5-37)能够降低TNF-α水平。6个抗菌肽都具有低的溶血活性。同时，将抗菌肽应用于体内，减缓降解，增加生物利用度，成功构建了携载OH-CATH30纳米粒缓释体系。中华大蟾蜍皮肤中抗菌肽研究的开展，为抗菌、免疫调节、拮抗内毒素等方面药物的开发提供了的先导分子，同时对中华大蟾蜍皮作为一味重要中药使用提供了有益指导。