中文摘要：

短散在核重复序列（SINEs）是真核基因组内的重复序列，在基因组内存有大量拷贝，并能借助细胞内的酶系进行返转座。实验证实它在基因组内具有广泛的调控作用，并随体内外环境因素的刺激而发生相应的调控。SINEs涉及个体发育过程的调控作用已得到部分实验证实，但都是单基因调控结果，具体到某些SINEs在个体发育全过程的调控模式还未见报道，本研究是以斑马鱼个体发育全过程为研究对象，从受精卵到成体发育的各个关键点选取实验材料，结合以前创建的反向PCR分离和鉴定SINEs的方法，鉴定斑马鱼基因组内的新SINEs，利用即时定量PCR分析所得SINEs在发育过程中的表达，获得SINEs表达的关键时期，再构建相应的基因组和cDNA文库，用相应SINEs杂交文库，获得与SINEs相关基因，并进行基因的体外转录验证，用以研究SINEs在发育过程的功能，并希望获得某一SINEs在斑马鱼个体发育过程中的调控模式。

结论摘要：

本项目以斑马鱼个体发育为研究对象，反向PCR方法分离SINEs，并结合斑马鱼基因组数据库，鉴定了斑马鱼基因组内的SINEs，再以斑马鱼个体发育不同的时期的RNA为模板，荧光定量PCR鉴定相关SINEs在斑马鱼个体发育过程中的表达差异，并获得了SINEs特殊的表达时期。在此基础上，通过数据库的比对，获得了SINEs在斑马鱼25条染色体上的分布情况。为了获得全部与SINEs在胚胎发育过程中相连的功能基因，我们选取了比较有代表性的三个时期进行转录组分析，即受精卵、球状胚和幼体三个时期。同时，受精卵可以作为所有样品的对照。对各样品测序获得的reads数据进行评估，测序总共获得18.5Gb数据量，总reads数为91,392,276条，其中1细胞期获得29,716,782 Reads数；球形期获得的Reads数为34,809,504；而幼体期获得的Reads数为26,865,990，Q30均达到80%。各个时期样品所获得的reads与参考基因组比对后，其效率均在75%左右。最终结合转录组分析，获得了所有71个SINEs相关的基因序列，选择SINE插入到十个蛋白编码基因的3’UTR区域作为突破点，然后通过PCR鉴定了DNAN与之相关的基因。最终选定三个基因，它们是E3泛素连接酶1a、类内质网高尔基体中间间隔蛋白2、以及一个未知功能基因。在以上结果的基础上，为了验证DANA与这三个功能基因的关系，进行了DANA干涉实验，以验证DNAN对这三个功能基因的调控关系，但没有获得预期结果。最终分析原因是斑马鱼胚胎发育各时期时间短，到球状胚时才4个小时左右，而设计的干涉探针，显微注射到受精卵后，至少12个小时才能起作用。在实验基础上，利用体外转录和CRISPR-Cas9的技术，对斑马鱼受精卵进行相关SINEs区域的敲除，敲除结果显示，所有受精卵不能正常发育到原肠胚期。为进一步验证DNAN在插入的3’UTR区与相关基因的调控关系，把含有和不含有DNAN的UTR区和荧光蛋白基因相重组，再转染到真核细胞中，进行DNAN调控功能的检测，结果发现含有DNAN序列的3”UTR区的荧光强度远大于不含有DNAN序列的荧光强度，这一结果说明SINEs在3”UTR 区的调控作用主要体现保证mRNA的稳定性。该结果为SINEs在基因调控的功能上提供新的证据，也是在SINEs的功能研究上，首次发现SINEs