中文摘要：

防御素是动物体内产生的一类内源性抗菌肽，大量研究表明在致病菌的刺激下防御素表达量增加，其诱导的信号通路是炎症介质激活核转录因子NF-kB。而关于益生菌与防御素表达之间的关系及机理尚不完全清楚。本课题组已成功的克隆了驯鹿胃肠道β-防御素基因。本项目以驯鹿为研究对象，选用反刍动物普遍饲用的7种益生菌，通过在体外培养的驯鹿胃肠道上皮细胞内加入不同益生菌以及益生菌的不同成分，采用荧光定量PCR、Western Blot和免疫细胞化学等方法，从mRNA和蛋白质水平研究益生菌对驯鹿β-防御素表达的诱导规律，确定并分离其有效的诱导成分，研究诱导成分激活防御素表达的信号通路，从分子水平上揭示不同益生菌对驯鹿防御素的调控机理。该研究成果不仅对理解益生菌与防御素之间的关系有重要意义，而且有助于在分子水平上揭示驯鹿胃肠道的抗感染免疫防御机制。同时，有望对驯鹿人工饲喂益生菌制剂提供指导。

结论摘要：

为了探索益生菌对瘤胃上皮细胞内防御素表达的调节作用和调控机理，本项目首先培养绵羊瘤胃上皮细胞，通过不断优化培养条件后建立了稳定的培养体系，在鉴定所培养的细胞为绵羊瘤胃上皮细胞的基础上，选用三种益生菌（乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌）刺激培养的绵羊瘤胃上皮细胞，运用实时荧光定量逆转录PCR（RT-qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）检测与益生菌共培养后的绵羊瘤胃上皮细胞中β-防御素-1（sheep beta- defensin-1, SBD-1）mRNA和蛋白的表达量。结果表明三种益生菌均可诱导绵羊瘤胃上皮细胞内SBD-1 mRNA和蛋白的表达量增加，当刺激时间一定时，SBD-1 的表达量随着菌液浓度的增加均呈先升高后降低的趋势；当菌液浓度一定时，SBD-1 的表达量也是随着刺激时间的延长呈先上升后下降的趋势。其中两株乳酸杆菌即干酪乳杆菌Zhang和植物乳杆菌P-8在其浓度为10(7) CFU·mL-1刺激细胞8 h时SBD-1的表达量最高，而植物乳杆菌P-8强于干酪乳杆菌Zhang，进一步的研究表明植物乳杆菌P-8的灭活菌亦可显著诱导SBD-1的mRNA及蛋白表达，但弱于活菌；枯草芽孢杆菌在其菌液浓度为10(10) CFU·mL-1刺激细胞8h后，SBD-1的表达量达到最高；酿酒酵母菌在其菌液浓度为5.2×10(7) CFU·mL-1刺激时间为12 h SBD-1的表达量达到峰值。在此基础上，本项目又选用NF-kB信号通路特异性抑制剂PDTC及MAPKs信号通路ERK 1/2、p38和JNK特异性抑制剂PD98059、SB202190和SP600125分别与加益生菌的绵羊瘤胃上皮细胞共培养（试验组），利用RT-qPCR检测试验组与只加益生菌的绵羊瘤胃上皮细胞（阳性对照组）的SBD-1 mRNA表达水平的变化。结果表明4种抑制剂对3种益生菌促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1的诱导表达都具有抑制作用，但抑制效果均有差异，其中p38特异性抑制剂抑制效果最强。因此可以推测，在益生菌促进绵羊瘤胃上皮细胞SBD-1表达的过程中NF-kB通路和MAPKs中ERK1/2、JNK和p38这几条信号通路都有参与，但参与程度不尽相同，并推测p38信号通路的作用尤为关键。本研究结果为进一步开发反刍动物益生菌制剂提供了理论基础，同时有助于在分子水平上揭示反刍动物胃肠道抗感染免疫的防御机制。