中文摘要：

从蛇足石杉中分离提取的石杉碱甲，是治疗早老性痴呆新药的主要成分，其来源匮乏严重限制新药的研发利用，开辟石杉碱甲新的来源途径已迫在眉睫。申请人首次提出基于宏量ESTs（Comprehensive ESTs）分析蛇足石杉的转录组信息，筛选并鉴定石杉碱甲合成关键酶基因的方法，为探索利用生物技术生产石杉碱甲奠定基础。石杉碱甲合成酶（HAS）是石杉碱甲合成途径最末端的限速酶。本研究已利用GS FLX高通量测序技术获得了30万条蛇足石杉叶的ESTs。①将对宏量ESTs进行BLAST、GO、KEGG等分析，获得蛇足石杉的转录组信息及HAS候选ESTs。②结合Real-time PCR筛选受茉莉酸甲酯诱导表达的HAS候选基因。③通过候选基因的异源表达及LC/MS酶活性检测法，鉴定HAS功能。本研究将为阐明石杉碱甲生物合成的分子机制以及开辟利用生物技术生产石杉碱甲新途径奠定基础。

结论摘要：

石杉碱甲是治疗早老性痴呆症新药的主要成分，具有极好的应用前景，其原植物是蛇足石杉，同属其他植物如龙骨马尾杉体内也含有石杉碱甲。但石杉属植物的基因组和转录组信息都十分缺乏，对石杉碱甲生物合成途径的研究仍极为有限。本研究完成了以下研究内容①利用罗氏454 GS FLX高通量测序技术完成了蛇足石杉全草的转录组测序；同时为高效发现石杉碱甲合成途径的相关基因，通过比较转录组学的方法，也对龙骨马尾杉进行了转录组分析；还利用传统的表达序列标签（Expressed sequence tag，EST）技术对蛇足石杉叶片的基因表达情况进行了分析。共获得36,763条蛇足石杉和31,812条龙骨马尾杉的454转录本以及3451条蛇足石杉叶片的Sanger转录本。在454转录组数据中，共注释到115个蛇足石杉和98个龙骨马尾杉的转录本与生物碱、萜类、黄酮/类黄酮等化合物的生物合成相关。②筛选到石杉碱甲合成酶候选基因根据推测的石杉碱甲生源途径，石杉碱甲合成酶可能是一种CYP450，且应在这两种植物中共表达。在蛇足石杉和龙骨马尾杉中共同表达的63个CYP450s中，利用real-time PCR检测到20个CYP450s在叶中表达丰度较高而在根中表达较低。这与石杉碱甲在蛇足石杉中的器官特异性分布即叶中含量最高、根中含量较低相一致，推测它们可能参与石松碱的生物合成；再根据系统进化树的分析结果，发现有4个基因（Hs01891、Hs04010、Hs13557和Hs00093）与生物碱合成酶具有较近亲缘关系，它们最可能是编码石杉碱甲合成酶的候选基因。③已成功将Hs00093在酵母中进行了蛋白异源表达，其酶学活性的鉴定研究仍在进行中。此外，还在蛇足石杉中克隆了可能参与石松碱生物合成的第一个关键酶——赖氨酸脱羧酶基因和3个参与三萜合成的酶基因，数千个简单序列重复（SSR）遗传位点和转录因子以及参与植物生长发育调节的基因也被首次发现。本研究首次为石杉属植物的功能基因组学研究提供了大量的转录组数据，为开展该属植物的分子育种研究提供了丰富的分子标记位点，为深入研究石杉碱甲生物合成途径奠定理论基础。