中文摘要：

β诺达病毒（Betanodavirus）属于分节段正链RNA病毒，基因组由两条正义RNA组成。该病毒能感染5个目17科的40多种经济鱼类，引发病毒性神经坏死症，仔鱼和稚鱼死亡率接近100%，国际兽疫组织认定其为严重疫病。该病从1985年发现至今，已遍及全球，仍无有效防治方法，近年来在我国频繁爆发，造成严重危害。我们以本课题组分离自患病牙鲆的β诺达病毒（PONNV毒株）为对象，建立反向遗传学操作系统，在DNA水平操作其基因组RNA，向RNA1节段5'端78bp非翻译区引入突变，采用培养的细胞和无细胞表达系统组装带有定向突变的子代病毒，利用敏感细胞及活体动物在完整病毒颗粒水平分析突变序列对病毒侵染、复制和聚合酶表达的影响，阐明该区段在病毒复制与聚合酶表达过程中的作用。研究成果不仅为深入探讨此类病毒侵染和传播机制奠定基础，也可用于研制反向疫苗，控制该病发生和流行，具有明显的理论意义和应用价值。

结论摘要：

β诺达病毒（Betanodavirus）属于分节段正链RNA病毒，基因组由两条正义RNA组成。该病毒能感染5个目17科的40多种经济鱼类，引发病毒性神经坏死症，仔鱼和稚鱼死亡率接近100%，国际兽疫组织认定其为严重疫病。该病从1985年发现至今，已遍及全球，仍无有效防治方法，近年来在我国频繁爆发，造成严重危害。以本实验室组分离自患病牙鲆的β诺达病毒（PONNV毒株）为对象，建立反向遗传学操作系统，在DNA水平操作其基因组RNA，向RNA1节段5’端78bp非翻译区引入突变，采用培养的细胞和无细胞表达系统组装带有定向突变的子代病毒，利用敏感细胞及活体动物在完整病毒颗粒水平分析突变序列对病毒侵染、复制和聚合酶表达的影响，进而探讨该区段在病毒复制与聚合酶表达过程中的作用。结果表明根据该病毒基因组的序列特征，可通过将SP6启动子以及特定限制性内切酶准确连接到该病毒双节段基因组序列两端从而实现其全序列的无冗余转录，产物具有感染性。在此基础上，结合保守性分析与RNA二级结构热力学计算结果，并借助前述反向遗传操作系统构建选定的目标区域突变体，证实了该病毒RNA1节段5’末端核苷酸对病毒复制影响不大，但自第10位核苷酸起的UTR区间系病毒聚合酶表达及拯救必须。通过在RNA1节段编码的病毒聚合酶两分别端融合EGFP基因可进行示踪，但未实现病毒颗粒拯救，推测有两方面原因，一是该病毒具有包装限制，基因组总量不能超过野生型的110%，二是融合的绿色荧光蛋白影响了病毒聚合酶效力的发挥。此外为了快速诊断该病毒的感染，通过设计特异性引物建立了一种基于环介导等温扩增的检测方法并获批国家发明专利授权。本研究的相关成果可为同类研究提供有价值的参考。