中文摘要：

Hsp90与其共分子伴侣Cdc37可指导胰腺癌细胞内多种致癌蛋白激酶翻译后折叠与亚基装配，参与肿瘤细胞内多条信号通路。鉴于目前国内外对以阻断Hsp90/Cdc37结合为靶点的特异性抑制剂研究尚属空白，本项目前期对两蛋白结合位点进行了机理性研究，找到了对二者结合具有决定性作用的Hsp90Glu47/Cdc37Arg167氨基酸位点。本项目拟根据此位点空间结构，整合生物化学、生物信息学和有机化学学科知识，设计合成阻断Hsp90/Cdc37结合的新型Hsp90抑制剂；综合运用荧光共振能量转移技术、海肾荧光素酶双分子互补技术及免疫共沉淀技术，对抑制剂阻断效果进行评价；并以PANC-1细胞和RIP-Tag2小鼠为模型，初步探讨抑制剂在抗胰腺癌细胞增殖中的作用。本项目有望为以阻断Hsp90/Cdc37结合为机理的新型Hsp90抑制剂研究提供佐证，同时为开发高特异性胰腺癌治疗新药提供分子水平理论基础。

结论摘要：

Hsp90与其共分子伴侣Cdc37通过形成复合物，指导下游多种致癌客户蛋白激酶成熟，参与胰腺癌细胞内多条信号通路。本项目以Hsp90/Cdc37复合物为靶点，首先建立了基于SRL-PFAC的蛋白水平Hsp90/Cdc37抑制剂筛选体系，克隆了pET30a-NRL-Hsp90和pET30a-Cdc37-CRL原核表达载体，在大肠杆菌中表达并利用Ni-NTA亲和层析纯化了NRL-Hsp90和Cdc37-CRL重组蛋白。摸索了NRL-Hsp90和Cdc37-CRL蛋白在96孔板中的最适反应条件。表达纯化了突变蛋白NRL-Hsp90 (Q133A) 和Cdc37 (R167A)-CRL，并选取了6种已知的Hsp90抑制剂对构建的筛选体系进行验证，结果表明我们构建的筛选体系用于Hsp90/Cdc37小分子化合物抑制剂筛选具有很高的特异性。我们利用建立的筛选方法对100余种化合物进行了筛选，找到了一种黄酮类化合物芹菜素（Apigenin）可以有效抑制HEK293T细胞中NRL-Hsp90/Cdc37-CRL互补活性，阻断Hsp90/Cdc37相互作用，抑制胰腺癌细胞增殖和迁移，降低胰腺癌细胞中Hsp90/Cdc37下游客户蛋白AKT，CDK4和MMP-9表达水平，诱导胰腺癌细胞内ROS时间依赖性和浓度依赖性积累；除了从已有化合物中进行广泛筛选外，我们还从忍冬科植物苦蘵中分离出了一种化合物GJH-51，与其结构类似物相比，可以降低细胞内NRL-Hsp90/Cdc37-CRL互补荧光素酶活性，降低Hsp90/Cdc37免疫沉淀复合物中Cdc37水平，有效抑制胰腺癌PANC-1细胞增殖，增加PANC-1细胞内Hsp70水平，降低Hsp90/Cdc37客户蛋白AKT、CDK4和Survivin水平。本项目的开展有望为以阻断Hsp90/Cdc37结合为机理的新型Hsp90抑制剂研究提供佐证，同时为开发高特异性胰腺癌治疗新药提供分子水平理论基础。