中文摘要：

刺参作为重要的海水养殖生物，目前尚没有刺参盐度调控基因的相关报道，而海水盐度变化又会给刺参养殖产业造成极大的经济损失。开展盐度调控基因的筛选、功能验证及时空表达模式分析研究工作十分必要，具有科学研究价值。项目拟通过抑制消减杂交方法筛选盐度调控基因，利用Real time RT-PCR和Western Blot检测盐胁迫下基因在不同组织不同处理时间下的定量表达，揭示基因时空表达模式。通过建立有效的RNAi体系，检测基因沉默后的效果，对基因的生物学功能进行深层次的分析。项目结果将有助于掌握刺参盐度调控内在变化规律，为阐明刺参盐度调控机理奠定基础，丰富刺参养殖的基础生物学理论。筛选的优良基因可实现刺参抗逆基因工程定向育种，提高刺参对盐度变化的抵抗力和适应能力,增强免疫抵御机制和细胞应激保护能力，解决因盐度限制导致的养殖海域面积的瓶颈问题。对刺参养殖业的健康可持续发展具有重要的科学意义。

结论摘要：

课题总体进展顺利，在依托单位和各成员的努力下，完成了计划任务。项目成功构建了刺参盐度胁迫下的消减文库，分析了18个基因的表达调控规律；成功构建刺参溶菌酶基因RNAi技术体系。在国内外公开刊物发表研究论文8篇，其中SCI收录1篇，在审SCI论文2篇，申请专利3项，授权1。项目构建了的消减文库经测序获得999条ESTs，有356个差异表达序列获得注释。文库中涉及到的主要代谢通路有氧化磷酸化通路、转运RNA通路、氨基酸代谢、糖酵解、丙酮酸代谢、钙信号通路、磷脂酰肌醇信号通路、磷酸肌醇代谢、鞘脂类代谢等。由此可见，低盐胁迫下刺参盐度调节适应机制需要多个代谢和信号通路共同参与。 筛选出18个与盐度胁迫相关的基因进行实时分析，发现表达上调的基因有同型半胱氨酸甲基转移酶、磷酸丝氨酸转氨酶、H+-ATP酶、热休克蛋白70、泛素连接酶、双特异性磷酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶抑制剂、磷脂酶A2、受体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶；表达下调的基因有水孔蛋白、醛脱氢酶、半胱氨酸合酶、谷氨酸脱羧酶、Na+/K+-ATP酶、K+离子运输、Na+/Cl-依赖性氨转运蛋白、纤维凝胶蛋白A、丝氨酸蛋白酶、补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白。从定量表达存在差异的基因中选取了Na+/K+-ATP酶(MS-1)、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(MS-2)、酰基辅酶A脱氢酶(MS-3)、H+-ATP酶(MS-4)、K+运输(MS-5) 5个差异极显著的基因进行SNP位点的分析，获得五个SNP标记位点在刺参低盐胁迫中可能起着重要作用。 研究通过设计刺参溶菌酶基因的人工miRNA，构建表达溶菌酶基因miRNA的重组质粒，并建立溶菌酶基因的真核重组质粒，将两种重组载体共转染到HEK293细胞中，用荧光显微镜观察细胞中有大量的荧光蛋白EGFP表达，说明成功建立了稳定表达含溶菌酶基因miRNA干扰质粒的HEK293细胞株。将重组的真核表达载体与各重组的miRNA干扰载体共转染到靶基因HEK293细胞24h后，收集细胞进行qPCR检测其干扰表达效果。4种重组miRNA干扰载体对溶菌酶基因的沉默效率分别为62%、70%、55%、60%。初步验证miRNA重组质粒在HEK293细胞中对真核重组质粒产生的目的基因的抑制作用，并筛选出其中最为有效的miRNA重组质粒。