中文摘要：

椎间盘细胞衰老是椎间盘衰老的微观表现，椎间盘细胞衰老的过程是借助信号转导通路实现的。既往研究表明椎间盘衰老与椎间盘退变密切相关。益气化瘀补肾方已被证明可以延缓椎间盘退变，但是国内外还没有从椎间盘衰老的角度研究中药的作用机制。本研究在建立C57BL/6J小鼠椎间盘原代脊索细胞衰老模型的基础上，以及利用D-半乳糖诱导整体早衰动物模型，通过细胞培养、基因过表达和RNAi，运用免疫组化、细胞荧光免疫、实时定量荧光PCR和Western blot等技术，观察椎间盘衰老细胞中PTEN-p27KIP/RB信号转导通路相关信号分子的表达情况，揭示椎间盘衰老机制，验证益气化瘀补肾方通过调控内环境延缓椎间盘衰老的作用机理及作用新靶点，为延缓衰老提供新的研究思路和方法，探讨"肾主骨""气血理论"与椎间盘衰老相关的现代生物学机制，为中医"肾藏精，精生髓，髓生骨"及"气血理论"理论提供部分科学阐释。

结论摘要：

椎间盘源性疾病危害人类健康，根本病理变化是椎间盘发生了级联性的加速退变，与正常椎间盘的衰老过程不同，退变的椎间盘细胞代谢紊乱、内外信号失调、基质丢失是一种典型的衰老性疾病。细胞的生命处于周而复始不断更新中，每一个周期都受到细胞周期信号传导通路的严密调控，PTEN-p27KIP/RB途径是控制细胞周期的关键信号传导途径之一，当信号通路受到退变信号影响时，椎间盘细胞自我更新能力下降从而加速衰老。中医“肾主骨”理论是指导中医药延缓椎间性的基础理论，其延缓退变的机制之一可能与调控PTEN-p27KIP/RB信号途径相关。本项目主要研究内容（1）体内D半乳糖诱导的椎间盘衰老模型和益气化瘀补肾方干预PTEN-p27KIP/RB 信号传导通路的研究8周龄C57BL/6J小鼠60只分为六组正常对照组，D半诱导衰老模型组，益气化瘀补肾方干预组，益气化瘀方干预组，补肾方干预组和维生素E干预组。病理形态学证明D半乳糖诱导可加速椎间盘退变，细胞增殖下降，衰老增加，并伴有软骨基质退变。与模型组比较，益气化瘀补肾方组有延缓椎间盘退变的作用，形态学评分和细胞衰老等指标有明显的改善。免疫组化和PCR证实益气化瘀补肾方降低PTEN和升高RB基因的mRNA表达。（2）体外椎间盘细胞衰老模型的建立及益气化瘀补肾方中药单体干预 PTEN-P27KIP/RB 信号传导通路的研究建立了小鼠原代椎间盘髓核细胞培养和诱导衰老模型，通过阿尔新蓝和Col II阳性染色鉴定可区分脊索原代细胞；益气化瘀补肾中药单体可以改善D半乳糖诱导的脊索细胞增值抑制。PCR证实益气化瘀补肾中药单体通过上调Cyclin D1和下调 PTEN 基因 mRNA的表达，从而促进细胞增殖来抵抗D半乳糖诱导的衰老。（3）建立过表达或RNAi PTEN和P27KIP诱导小鼠椎间盘原代脊索细胞衰老模型及中药单体干预PTEN-P27KIP/RB信号传导通路的研究。益气化瘀补肾中药单体干预过表达或RNAi PTEN和P27KIP诱导小鼠椎间盘原代脊索细胞衰老模型，细胞周期 PCR Array的检测结果发现对PTEN过表达的脊索细胞，能降低G1/G0期的比例，有一定的促进增殖作用。对PTEN和P27KIP共同过表达的脊索细胞也能降低G1/G0期的细胞比例，对细胞增殖有促进作用。