中文摘要：

细胞因子能通过多种信号转导方式刺激肿瘤细胞跨膜转运蛋白的高表达, 引起药物外排，导致肿瘤多药耐药性。那么我们能否发现并揭示这些信号通路来预防或逆转肿瘤多药耐药性呢？要实现这一目标，基本前提就是精确定量测定细胞因子的表达水平。然而我们发现，目前采用的细胞因子检测手段均存在一定缺陷，不同检测手段的结果则显示出较大的差异性。与这些方法相比，基于质谱的定向蛋白质组学作为近两年最值得关注的技术之一(Nat. Methods)，表现出了更高的选择性和更快的分析速度，这种优势在对组成复杂的生物样本进行多个蛋白质同步测定时尤其明显。因此，我们计划通过基于质谱的定向蛋白质组学，建立和发展具有高灵敏度、高特异性、高准确度和高通量的细胞因子精确定量检测方法，测定和比较细胞因子在多药耐药细胞及其亲本细胞中的表达水平，再对具有显著性差异的细胞因子改变其生物学功能，最终发现和揭示细胞因子和肿瘤多药耐药的相关性。

结论摘要：

随着社会发展节奏的加快，各种压力随之增加，肿瘤已成为现今人类健康的最大威胁之一。在与肿瘤的斗争中，肿瘤细胞产生的多药耐药性是造成化疗失败的一个重要原因。针对这个问题，多药耐药机制正逐渐成为肿瘤治疗研究的新焦点。其中，由跨膜转运蛋白(例如P糖蛋白P-gp)的高表达引起的药物外排及细胞内药物浓度的降低是近年研究的主要方向。科学研究表明，由肿瘤细胞自身合成分泌的细胞因子能够通过多种信号转导方式刺激肿瘤细胞跨膜转运蛋白的高表达。那么我们能否发现并揭示这些信号通路来预防或逆转肿瘤多药耐药性呢？要实现这一目标，基本前提就是精确定量信号转导通路中蛋白质的表达水平。然而我们发现，目前采用的蛋白质检测手段均存在一定缺陷，不同检测手段的结果则显示出较大的差异性。与这些方法相比，基于质谱的定向蛋白质组学表现出了更高的选择性和更快的分析速度，这种优势在对组成复杂的生物样本进行多个蛋白质同步测定时尤其明显。因此，本研究中我们首先应用文献检索和系统级分析等方法，并结合预实验结果，发现细胞外信号调节蛋白激酶ERK1/2和热休克因子HSP27对跨膜转运蛋白的表达可能有调控作用。然后，通过定向蛋白质组学建立和发展了P-gp、转铁蛋白受体TfR、叶酸受体FR、ERK1/2以及HSP27的定量方法，并比较了它们在多药耐药细胞MCF-7/ADR和相应的亲本细胞MCF-7/WT中，以及乳腺癌患者癌组织和癌旁组织中的含量；并对乳腺癌组织临床病理学特点，包括肿瘤大小、肿瘤分级和淋巴结转移状态等，进一步对比分析。实验中,我们还发现ERK1/2和HSP27的磷酸化水平也能在很大程度上对跨膜蛋白的表达起作用。因此，我们进一步监测了阿霉素作用下MCF-7/WT细胞中HSP27和ERK1/2磷酸化水平的变化，并生物学验证了它们在肿瘤细胞多药耐药中的功能。另外，针对实验中出现的蛋白质低丰度和同质异位点磷酸化的问题，我们也分别采用了多肽免疫亲和/分子印迹富集方法以及线性代数的数学手段来解决。本研究的结果表明定向蛋白质组学能在定量的基础上，揭示细胞因子和肿瘤多药耐药的相关性。今后，这种方法可进一步发挥其准确和精确的优势和特性,通过对多药耐药相关蛋白的监测，有针对性地调节起关键作用的信号转导方式来提高肿瘤细胞对化疗药物的敏感性，最终改善临床上肿瘤治疗的效果。