中文摘要：

通过OPG/RANK/RANKL调控途径诱导破骨细胞，在培养过程中用不同浓度的OPG处理，在培养的不同时间采用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、电镜等观察破骨细胞骨架微丝、微管、中间丝及足体、环状封闭带等形态的变化，并检测破骨细胞骨架的重要组成成分微管蛋白（α-微管蛋白和β-微管蛋白）、肌动蛋白和波形蛋白的表达。在此基础上，用免疫印迹法和荧光定量PCR检测调控破骨细胞骨架形态的Rho蛋白及其相关信号分子的表达，检测调控破骨细胞环状封闭带形成的cortactin、DC-STAMP及c-Src等信号蛋白的表达，检测调控破骨细胞黏附结构形成的桩蛋白、粘着斑蛋白、整合素、动力素等信号蛋白的表达。揭示Rho蛋白及其信号分子对破骨细胞骨架形态的调控作用，确定OPG抑制破骨细胞分化成熟过程中影响环状封闭带和黏附结构形成的关键调控因子，为从分子水平揭示OPG抑制破骨细胞分化成熟的机理提供科学依据。

结论摘要：

破骨细胞具有独特的骨吸收活性，细胞骨架参与细胞内物质运输、信息传递、能量转换、细胞分化与分裂等活动，破骨细胞的骨吸收活性与细胞骨架密切相关。本项目旨在研究破骨细胞分化过程中细胞骨架的变化和调控机制。 结果表明（1）在诱导破骨细胞分化过程中，细胞骨架、细胞形态和相关调节因子的表达均发生了剧烈的变化。Cdc42v1、RhoU和RhoF分别调节着三种不同类型丝状伪足的形成，而Rac1、Rac2和FLNA可能与细胞的选择性有关。（2）OPG作用于破骨细胞前体细胞可导致丝状伪足变短、增多，OPG能够通过Rho GTPases信号通路中的Arhgef8/Net1和DOCK5以及Cdc42、RhoU、RhoF的表达，进而影响破骨细胞前体细胞丝状伪足的形态学和数量的变化，最终抑制了破骨细胞的形成。（3）破骨细胞分化过程中第5d形成封闭带，OPG处理影响封闭带的结构。OPG能够通过抑制Rho GTPases信号通路相关基因的表达，影响伪足小体的分布，从而造成封闭带的损伤或破坏，进而抑制了破骨细胞的骨吸收活性。（4）破骨细胞为了适应OPG的调控，将Src作为衔接蛋白，代偿减少了Pyk2，并与Pyk2一起从破骨细胞外周黏附区域向中心区域转移。说明，OPG通过调控破骨细胞内Pyk2和Src磷酸化及其在细胞内的分布情况，破坏破骨细胞黏附结构。（5）OPG抑制了破骨细胞生成和黏附结构的形成，显著降低了[Ca2+]i、Pyk2和Src-pY527磷酸化水平，并使Src-pY416磷酸化水平显著增高。抑制剂明显抑制了OPG对破骨细胞分化和黏附结构的作用及Src-pY416磷酸化水平升高。说明OPG通过Ca2+和ERK信号通路破坏破骨细胞黏附结构，激活Src使其作为衔接蛋白补充减少的磷酸化Pyk2，而p38 MAPK信号通路可能在这过程中发挥着不同的作用。（6）OPG使多核的破骨细胞CD44、CD47、DC-STAMP、ATP6V0D2和总Cx43的表达水平显著下降。OPG与ATP联合作用，多核破骨细胞数目显著增多，这些融合相关因子的表达量显著上升。而OPG降低了破骨细胞及前体细胞中CD44+、CD47+、DC-STAMP+、ATP6V0D2+、Cx43+细胞在总体的分布比例。表明OPG通过不同的机制分别调控多核破骨细胞和单核的前体细胞融合，这些调控机制都可能涉及ATP信号通路。