中文摘要：

MSC体内应用的一个重要前提是体外安全和高效的扩增。研究发现MSC在体外长期培养后会自发恶性转化，且MSC参与了肿瘤的形成。此外，miRNA与肿瘤的发生关系密切。我们研究表明MSC自发恶性转化是由于TGFβ信号通路上调，凋亡相关基因Fas和抑癌基因p53表达下调，而癌基因c-Myc激活导致了染色体的异常所致。本研究拟用申请者建立的自发恶性转化的家猪MSC为模型，采用aCGH技术和miRNA芯片技术检测基因拷贝数变化及miRNA表达谱，并结合生物信息学方法寻找显著差异的miRNA靶基因。将目标miRNA的表达或拮抗序列导入细胞，结合荧光素酶活性实验和Western blotting验证miRNA靶基因；观察miRNA转染后细胞增生、分化的改变及植入小鼠后成瘤情况。本项目的预期结果将为MSC临床应用预警和防止转化提供新策略与措施，也为肿瘤干细胞发生、发展的研究提供新线索。

结论摘要：

骨髓间充质干细胞 (MSCs)具有自我更新、增殖及多向分化的潜能，在体外可被诱导分化为骨、软骨、肌肉、脂肪和神经等组织细胞，还能进行遗传修饰，成为再生医学、组织工程和基因治疗领域研究的热点。MSCs体内应用的一个重要前提是体外安全和高效的扩增。MSCs经过体外长期培养其生物学特性的改变和安全性值得关注。研究发现MSCs在体外长期培养后会自发恶性转化，且MSCs参与了肿瘤的形成。然而其分子机制并不是很清楚。本项目获得以下几个方面重要研究结果（1）进一步探讨了家猪MSCs在体外长期培养过程中染色体核型、分化能力的改变: 随着培养时间延长，染色体发生了变化，全部表现为三倍体，且MSCs逐渐失去干性，除成软骨分化能力外，其成骨、成脂肪分化能力逐渐减退，这可能与晚期细胞TGF β信号通路基础表达水平升高有关；（2）通过全基因表达谱芯片筛选出转化过程中上调表达的257条基因和下调的315条基因，信号通路分析发现部分细胞周期相关基因表达上调，部分ECM-receptor interaction、Focal adhesion、Regulation of actin cytoskeleton、Pathways in cancer、p53等通路相关基因表达下调；（3）通过miRNAs和编码基因甲基化表达谱的研究，明确表观遗传学调控在MSCs转化中的重要作用提示大量具有抑癌基因的miRNAs如let-7i、mir-34c等高甲基化参与细胞转化；甲基化芯片分析得到受甲基化调控的962条差异基因和1219条受去甲基化的基因，并发现这些基因主要参与细胞代谢、增殖分化、细胞结构、炎性免疫、肿瘤发生等生物过程；采用DNA甲基化芯片和基因芯片联合分析MSCs转化过程受甲基化调控的基因，结果发现多个受甲基化调控、参与干细胞分化的基因及参与的多个细胞信号通路，其中在12条甲基化下调而表达上调的基因中，很多具有调节肿瘤发生与免疫炎性相互平衡的作用，其中CDKN3启动子区甲基化状态改变，可能与细胞肿瘤化密切相关。（4）观察发现与成体MSCs不同，iPS诱导分化成的MSCs经长期培养不会发生恶性转化，提示不同来源的MSCs经长期培养后其生物学特性可能存在不同。本项目所取得的成果加深了对表观遗传学对miRNA和编码基因表达的调控在MSCs恶性转化中的重要作用的认识，为MSCs临床应用预警和防止转化提供新线索