中文摘要：

妊娠期糖尿病（GDM）宫内高糖环境已证实在排除遗传因素后增加子代患糖尿病风险，但发病机制不清。本实验室前期研究发现GDM小鼠子代胰腺细胞特异性损伤、亲源性印记基因Igf2修饰异常且存在隔代遗传。本项目将直接研究高糖对人胚胎干细胞（hESC）向胰岛细胞分化中Igf2/H19差异甲基化区（DMR）的调控及效应机制采用hESC诱导分化和胰岛细胞特异标志性基因及功能评价技术，观察高糖对hESC向胰岛细胞分化成熟过程的直接影响；定量PCR检测胰岛细胞发育及糖尿病发病密切相关基因Igf2和甲基转移酶（Dnmt）的改变；亚硫酸盐修饰后测序，检测Igf2/H19-DMR甲基化模式；单核苷酸多态性分析，确定印记紊乱相关编码基因突变类型；Dnmt转染及siRNA技术，验证甲基化修饰改变对hESC向胰岛细胞分化中Igf2/H19 DMR正负效应机制及胰岛细胞功能影响。为宫内高糖致胎源性糖尿病发病提供理论依据。

结论摘要：

研究背景和方向妊娠期糖尿病（GDM）已被证实在排除遗传因素后增加子代疾病风险，但发病机制不清。在本实验室发现妊娠期糖尿病小鼠宫内高糖环境致出生子代糖尿病表型，且胰腺细胞特异性损伤、印记基因Igf2修饰异常且有隔代遗传效应的基础上，利用hESC向胰岛细胞分化体外模型及功能评价技术，选择胰腺细胞发育及糖尿病发病密切相关基因Igf2及H19，结合在体模型，进一步明确高糖对胚胎发育期胰岛细胞表观遗传修饰的直接影响以及对胰岛细胞功能的影响，并从表观遗传层面研究宫内高糖环境对子代生殖细胞的影响机制，为GDM致糖尿病发病机理提供理论依据，为其他胚胎源性疾病研究开拓思路。研究内容1.比较分析hESC在高糖培养环境中诱导分化为成熟胰岛细胞与对照组的区别，鉴定胰岛细胞特异标志性基因表达，评价细胞功能；2.比较分析在高糖培养环境中人胚胎干细胞（hESC）诱导分化为成熟胰岛细胞过程中印记基因Igf2、H19的表达水平；3.研究在体模型中高糖对胰岛细胞的影响及机制以及对生殖细胞的影响机制；4.以宫内高糖环境研究为基础，研究其他不良宫内环境（如高雌等）对子代的影响，探索是否可消减宫内不良环境对子代的影响。研究结果和结论1. 将hESC进行体外培养并诱导分化为成熟胰岛细胞，分别为定向内胚层(DE)、前肠内胚层后端(PF)、胰腺内胚层及内分泌前体细胞(PE)及胰腺内分泌细胞(EN) 4个阶段，并进行了鉴定；2. 在分化过程中，Igf2及H19都呈现出先显著升高后降低的趋势，均在第2阶段表达水平最高；3.GDM子一代及子二代小鼠胰岛Igf2和H19表达均显著低于对照组，具有明显的亲源性印记特征；胎鼠胰岛细胞体外高糖培养后，Igf2和H19基因表达均显著低于对照培养组。4.GDM子代雄性胎鼠原始生殖细胞及精原细胞中Igf2及H19表达均降低，Dnmt1，Dnmt3a，Dnmt3b表达改变；睾丸组织表达谱186个基因上调，246个基因下调（Fold Change>2 & p<0.001）；5.电镜观察GDM组精原细胞线粒体大小各异，线粒体嵴肿胀，出现空泡，出现异型核，糖原堆积，内质网肿胀；6. 妊娠早期高雌激素环境与低出生体重（LBW）和小于胎龄儿（SGA）风险增加相关；卵泡和胚胎发育过程中，超生理浓度的雌二醇和孕酮水平会增加卵巢过度刺激综合症（OHSS）子代发生心血管功能障碍的发病风险。