中文摘要：

Killin是我研究组用自己发明的基因差异技术,筛选出的一个与DNA合成S期检测点相关的一个全新p53靶基因, Killin是DNA高亲合蛋白,通过与DNA的结合，从而阻止DNA的复制,半途停顿的DNA复制叉从而引发DNA修复检测点蛋白激酶的激活,到细胞凋亡的链锁反应。这一基于坚实实验证据的发现,很好地解释了p53调控细胞生长G1抑制(p21)及细胞凋亡(Killin杀死逃出G1，进入S期的细胞)。为了更深入地研究Killin的作用机理,我们提出以下三个假说:(1)Killin在DNA合成期与细胞内DNA单链结合蛋白RPA竞争,从而阻断DNA聚合酶的功能;(2)停顿的DNA复制叉,从而激活DNA修复检测点蛋白激酶ATM/ATR->CHK1/CHK2信息传导系统;(3)通过ATM/ATR-> p53->Killin 正反馈系统引发细胞凋亡信号通道。我们将从以上几个方面进行验证实验。

结论摘要：

p53 抑癌基因是控制细胞周期延伸及细吧凋亡最主要的转录因子，Killin是我研究组用自己发明的基因差异技术,筛选出的一个与DNA合成S期检测点相关的一个全新p53靶基因。 由于kilin基因位于第10号染色体上，与pTen抑癌基因紧密相邻，kilin操纵子的表观遗传学变化被发现与Cowden症及其它癌症的发生相关。 我们前期工作显示Killin是DNA高亲合蛋白,通过与DNA的结合，从而可以阻止体内和体外系统的DNA复制,该课题通过对RFP-Killin分别与GFP标记的DNA复制叉结合蛋白PCNA及内源单链DNA结合蛋白RPA在S期的共定位试验，结果显示RFP-Killin始终呈现出与这两种DNA复制相关蛋白相互排斥的点状细胞核分布，并且在非S期细胞中RFP-Killin多集中于rRNA的核仁内，而这两种RFP-Killin细胞周期特异分布均显示为高盐条件稳定的状态，证实RFP-Killin始终与细胞核内的核酸结合。这一重要发现为Killin在S期竞争性抑制DNA复制叉的形成及其在其它细胞周期负调控RNA的合成提供了分子基础。另外，根据Killin表达在真核及原核细胞内的毒性，用基因合成的方法在Killin最短致死功能区（N8－49aa）编码模板内通过同义突变引入多克隆位点，构建成功带有Histag－Killin表达的pKillin正选择基因克隆及表达系统。这一质粒不仅可以有效的克隆任何PCR产物，同时还能用来表达任何Histagged蛋白， 其基因克隆的特点在与当任何重组DNA片段在成功插入Killin最短致死功能区序列内后导致Killin致死功能失去活性，从而使重组pKillin质粒不再致死，得到菌落， 而任何非重组pKillin质粒因为Killin表达的致死功能，而得不到菌落生成。