中文摘要：

常染色体显性视神经萎缩（ADOA）是最常见遗传性视神经萎缩，其主要致病基因是OPA1。OPA1是定位于线粒体内膜和膜间隙的肌动蛋白相关GTP酶，具有促进线粒体膜融合和抗细胞凋亡的作用，对维持线粒体形态和功能至关重要。目前已发现多个OPA1基因突变，但突变基因对蛋白功能影响的研究甚少。本课题组在前期工作中发现了6种OPA1基因突变（包括4个新突变）。这6种突变可能是通过显性失活和单倍体剂量不足两种不同机制导致视神经萎缩，本课题将以此为切入点，利用分子生物学方法构建错义突变蛋白真核细胞表达载体，通过RNAi技术构建OPA1蛋白减少或缺失神经细胞，免疫荧光技术及生物化学等方法比较观察各种转染细胞（包括视网膜神经节细胞）线粒体形态和功能变化，比较各种转染细胞发生细胞凋亡和对细胞凋亡诱导剂反应的异同，探讨不同OPA1突变导致细胞损害的机制，为寻求治疗视神经萎缩的新靶点和新方法提供实验依据。

结论摘要：

常染色体显性视神经萎缩（ADOA）是最常见遗传视神经萎缩，其主要致病基因是OPA1。OPA1是定位于线粒体内膜及膜间隙的肌动蛋白相关GTP酶，具有促进线粒体膜融合和抗细胞凋亡的作用，对维持线粒体形态和功能至关重要。本研究对291名可疑遗传性视神经萎缩患者进行了OPA1基因突变分析工作，发现OPA1基因突变检出率20.6%。在这组研究对象中共发现了51种OPA1基因突变，其中37种突变为新发突变，最常见突变为缺失突变位于第27外显子的小缺失突变c.2708_2711delTTAG。为了进一步观察不同OPA1基因突变对线粒体形态和功能的影响，本研究构建了成重组表达载体pEGFP-N3/OPA1野生型和各种OPA1突变型，瞬时转染HeLa细胞，线粒体染料MitoTracker Red CMXRos标记线粒体，激光共聚焦显微镜观察野生型和各种突变型融合蛋白的亚细胞定位及线粒体形态；间接免疫荧光标记细胞色素c (cytochrome c), 荧光显微镜观察转染阳性细胞中细胞色素c分布；细胞转染后4小时加细胞凋亡诱导剂Staurosporine，24小时后Annexin V-PE标记凋亡阳性细胞，流式细胞仪检测各种转染阳性细胞对细胞凋亡诱导剂的敏感性。结果可发现，各种OPA1突变融合蛋白细胞的线粒体形态和功能均发生了明显异常。利用Lonza AMAXA 4D电转仪，将携带Oct4, Sox2, c-myc和Klf4的质粒电转进入患者和正常人肾上皮细胞，进行重编程培养，完成了正常人及携带c.2708_2711delTTAG患者肾上皮细胞重编程为诱导的多能干细胞（iPS）。正常人和患者肾上皮细胞和iPS细胞线粒体染料MitoTracker Red CMXRos标记线粒体及细胞色素c免疫荧光染色，免疫荧光显微镜或激光共聚焦显微镜观察未发现线粒体形态和细胞色素c分布的明显差异。正常人和患者肾上皮细胞和iPS细胞线粒体免疫印迹（Western Blot）分析显示患者iPS细胞线粒体OPA1蛋白表达水平明显低于正常人。本研究结果初步证实单倍体剂量不足是OPA1突变导致视神经萎缩的致病机理之一。