中文摘要：

感染可以损伤胰岛β细胞功能。申请者的前期研究发现胰岛β细胞在高糖等的刺激下发生氧化应激产生活性氧ROS（Ge QM, et al.CMB,2010）,进一步预实验中发现胰岛β细胞上有脂多糖（LPS）受体TLR4的表达，推测严重感染时LPS有可能通过对TLR4的直接作用影响胰岛β细胞，通过氧化应激诱导胰岛β细胞凋亡，使胰岛素等的分泌功能异常，机体血糖升高。本课题探讨了LPS对胰岛β细胞分泌功能、TLR4表达的影响，并从分子水平、细胞水平研究LPS对胰岛β细胞ROS生成、凋亡和TLR4之间的关系，以及在LPS对胰岛β细胞作用的上游和下游途径应用抗TLR4抗体、抗氧化剂α-硫辛酸分别进行干预，并进一步采用脓毒症大鼠模型验证体外实验结果。本研究旨在进一步探讨应激性血糖升高的分子机制，为控制改善危重病高血糖提供新的治疗途径。

结论摘要：

在严重感染、脓毒症等所致应激状态下，无糖尿病病史的中重度感染患者出现应激性高血糖的发生率约为50%。机体感染后出现血糖升高，胰岛β细胞损伤是其重要原因。引起β细胞功能减退的核心机制是氧化应激，ROS生成明显增多不仅损害胰岛素的分泌，还可诱导细胞凋亡。 本课题在原代细胞水平和INS-1胰岛β细胞株证实胰岛β细胞上有TLR4的表达，高浓度LPS使TLR4表达增加（P<0.05），LPS刺激胰岛β细胞12h后TLR4表达上调（P<0.05），随着时间进一步的延长TLR4的表达降低（P>0.05）。在0.01~10μg/mL范围内，LPS刺激24h后大鼠胰岛β细胞产生ROS增多，呈剂量依赖性（P<0.01）。我们发现，1μg/mL LPS作用INS-1细胞株48h，细胞内Bax蛋白水平升高到131.2%，而Bcl-2蛋白水平下降到51.5%。我们进一步对凋亡途径进行检测，结果证实，与对照组相比，LPS处理组Caspase-3和Caspase-8、caspase-9蛋白的表达、mRNA表达显著增加。课题组在LPS对胰岛β细胞作用的上游和下游途径应用抗TLR4抗体、抗氧化剂α-硫辛酸（α-LA）分别进行干预，结果发现抗TLR4抗体或α-LA干预后，胰岛β细胞活力没有明显降低，胰岛细胞ROS的生成降低，细胞平均荧光强度（MFI）降低，胰岛β细胞凋亡率降低，抑制LPS所引起的BAX/Bcl-2 mRNA和蛋白水平的增加（P<0.05）。为了明确TLR4在LPS所致氧化应激中的关键作用，我们构建了TLR4 shRNA，对TLR4基因沉默后，研究LPS对胰岛β 细胞活力、氧化应激和凋亡的影响。结果发现，与正常对照组比较，对TLR4沉默后，LPS抑制胰岛β 细胞的细胞活力、诱导氧化应激和发生凋亡的影响没有显著性差异，caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达变化没有统计学意义，说明LPS通过TLR4介导胰岛β细胞发生氧化应激，诱导胰岛β细胞凋亡。 本课题组进一步探讨脓毒症大鼠胰岛中TLR4表达、氧化应激、凋亡、胰岛细胞分泌功能的变化，并用抗TLR4抗体和α-LA分别进行干预，结果证实脓毒症大鼠胰岛TLR4表达上调，介导胰岛进一步氧化应激、凋亡，胰岛素分泌减少，其作用可部分被抗TLR4抗体和α-LA阻断。