中文摘要：

心肌缺血再灌注损伤是围术期的疑难问题，其损伤程度与氧自由基、钙超载及其介导的细胞凋亡密切相关。早期抗氧化、抗凋亡治疗是解决该问题的有效途径，但抗氧化、抗凋亡药物一般不能直接穿过细胞膜到达损伤部位因而影响治疗效果。蛋白质转导结构域(protein transduction domain, PTD)是以肽为载体的有效运输各种物质进入细胞及细胞核的系统。我们的前期工作提示融合蛋白在细胞水平的心肌保护作用。本项目拟构建PTD4-Cu，ZnSOD重组质粒，体外表达和纯化融合蛋白PTD4-Cu，ZnSOD，观察融合蛋白在大鼠缺血再灌注心脏模型中的心肌保护作用，检测融合蛋白的穿膜效率和融合蛋白作用前后不同时间点活性氧含量变化、氧化应激产物含量变化、重要心肌酶谱含量变化以及心肌梗死面积，探讨其心肌保护作用的机制。融合蛋白技术的应用有望解决抗氧化物质穿膜效率低下的问题，实现心肌缺血再灌注损伤治疗。

结论摘要：

心肌缺血-再灌注损伤机制虽未被完全阐明，但再灌注后最初数分钟内氧自由基过量产生是重要机制之一。铜锌超氧化物歧化酶(Gu/Zn-SOD)是细胞内主要氧自由基清除剂，可通过清除细胞内活性氧而减轻组织缺血再灌注损伤。但外源性Gu/Zn-SOD很难进入细胞内发挥生物学效应，从而限制了其在临床的应用。蛋白转导结构域（Protein Transduction Domain, PTD）具有携带大分子物质无特异性的穿越哺乳动物细胞膜的特性。因此PTD有望携带大分子Cu/Zn SOD进入细胞并发挥抗氧化效应。该课题构建、表达，纯化得到PTD4-Cu，ZnSOD融合蛋白用于其对缺血再灌注损伤心肌保护作用的研究。目前本课题组系统地完成了PTD4-Cu/ZnSOD融合蛋白在体内及体外试验中的心肌保护作用的研究。 1、成功设计并构建了新型蛋白转导结构域PTD，并与Cu/Zn SOD重组后表达、纯化得到水溶性的PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白并进行鉴定，申请专利（2014100858900）。采用固相合成法合成新型蛋白转导域PTD4，高效液相色谱分析仪和质谱仪测定其纯度和分子量。 2、证实了PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白能够穿透心肌细胞膜并保持活性。（1）邻苯三酚自氧化法检测证明PTD-Cu/ZnSOD融合蛋白具有高活性；（2）荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜观察穿膜肽PTD4能穿透细胞膜，且穿膜效应有时间和剂量依赖性；（3）小动物活体成像系统观察多肽PTD4在裸鼠体内呈动态分布并快速分布至全身；（4）采用液体石蜡封闭法，建立心肌细胞缺氧复氧损伤模型，加入不同浓度融合蛋白进行观察。免疫荧光显示细胞内代表PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白的荧光强度随浓度增加而增强，证明融合蛋白能够穿透细胞膜进入心肌细胞。 3、证实PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白对再灌注损伤心肌具有保护作用。（1）缺氧复氧损伤心肌细胞加入融合蛋白，心肌细胞坏死和凋亡明显减少；（2）结扎大鼠冠状动脉前降支建立大鼠缺血再灌注损伤模型，尾静脉注射融合蛋白，取心肌观察。大鼠心肌TTC染色显示，PTD-Cu/ZnSOD融合蛋白能够明显减少缺血再灌注损伤大鼠心肌梗死面积。 4、研究了PTD-Cu/Zn SOD融合蛋白对再灌注损伤心肌的保护机制。（1）融合蛋白处理的缺氧复氧模型中代表ROS的荧光信号明显减弱，表明融合蛋白增