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S. maltophilia DHHJ胞外胞内酶降解羽毛角蛋白协同增效作用机制解析
  • 项目名称:S. maltophilia DHHJ胞外胞内酶降解羽毛角蛋白协同增效作用机制解析
  • 项目类别:青年科学基金项目
  • 批准号:31000989
  • 申请代码:C170101
  • 项目来源:国家自然科学基金
  • 研究期限:2011-01-01-2013-12-31
  • 项目负责人:曹张军
  • 负责人职称:副教授
  • 依托单位:东华大学
  • 批准年度:2010
中文摘要:

禽类羽毛主要成份为角蛋白,是地球上最大的氮源废弃物之一,炼制产物用途广泛,生物炼制由于多种优点而成为目前潮流。酶是大分子物质生物炼制的关键因素,但当前角蛋白酶种类及作用方式不明,成为该方法产业化应用的瓶颈。申请者分离鉴定了一羽毛高效降解菌株(S. maltophilia DHHJ),并发现该菌株降解羽毛的活性依赖于胞内胞外酶协同作用。本项目在此基础上拟将纯化的胞内胞外酶独立及组合作用于羽毛,并且利用包括扫描电镜(SEM)、傅立叶红外光谱、拉曼光谱、能谱分析(EDS)在内的技术分析角蛋白酶降解过程及表面及截面动态变化情况;另一方面克隆胞内和胞外酶基因,推测酶蛋白结构及功能。综合以上实验及理论两方面深入解析DHHJ菌株角蛋白酶两种酶的协同增效作用机制。本项目的完成,将为角蛋白酶的应用提供理论支持,同时为酶分子改造及构建杂合酶奠定基础,具有重要的理论意义和应用价值。

结论摘要:

羽毛作为畜牧业副产物及自然界最大的氮源生物废弃物,其资源化利用对环境保护及可持续发展具积极意义。我们分离鉴定出一高效降解羽毛细菌(S.maltophilia DHHJ),在前期工作基础上及自然基金资助下完成以下工作 优化了S. maltophilia DHHJ 5 L发酵罐工业化降解羽毛工艺,明确了发酵产物主要成分(可溶蛋白大小为10-160kD),并研究了其作为叶面肥,护发素主要成分的应用。 通过提取胞外胞内酶处理羽毛,发现其共同降解羽毛效果高于单独作用。FTIR分析显示,胞外胞内酶协同处理后在1025 cm-1 (S-O),1540cm-1 (C-N、N-H),1640-1 (C=O),2920-1 (O-H)处出现差异,这与硫键及肽键打开相关。X射线结果通过Scherer公式计算,羽毛结晶度为 28.23%,其经胞外胞内酶协同处理后结晶度提高到34.46%,材料内部结构变得更为规则,酶及其它因子的触及性下降,更加难以作用。利用扫描电镜(SEM)及透射电镜(TEM)观察该菌在牛肉膏蛋白胨及羽毛两种培养基中细胞形态,发现羽毛培养基上细胞表面产生大量凹陷,细胞膜发生内褶。表明羽毛片段需进入细胞,在膜或膜内因子作用下进一步降解,作为营养成份供细菌代谢生长。 NanoLC-MS/MS结合PCR获得胞外酶(α/β水解酶)及胞内酶(aldo/keto 氧化还原酶)全基因序列,胞外酶蛋白中含有大量螺旋状结构,其与角蛋白中的α-螺旋结构互补结合,有利于酶底物的结合及羽毛降解。利用TMpred分析了aldo/keto氧化还原酶跨膜结构域,其有一个跨膜区,表明为膜蛋白,在膜上将胞外酶水解的角蛋白片段进一步氧化处理利用。同时,细菌降解羽毛过程中有磷酸盐结合蛋白、外膜孔蛋白、肽结合蛋白、周质氨基酸转运蛋白、ompF蛋白家族等参与。这说明酶虽然是微生物降解角蛋白的必要条件,但不是充分条件,除此外,还需要其它分子参与。而解析这些分子功能对于彻底了解羽毛生物炼制,提高降解效率至为关键。 本项目执行过程中发现细菌代谢产生H2O2可提高羽毛降解效率,研究了其代谢规律及体内外对酶降解羽毛的促进作用,该结果为微生物降解羽毛机理研究提供一条新的线索,同时也可为产业化应用提供新思路。


成果综合统计
成果类型
数量
  • 期刊论文
  • 会议论文
  • 专利
  • 获奖
  • 著作
  • 13
  • 0
  • 0
  • 0
  • 0
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