中文摘要：

生长分化因子5（GDF5）是影响胚胎期骨骼和关节发育的重要因子,在前期实验中我们发现两例中国汉族肢端畸形家系致病基因GDF5的新突变，其中引起近端指（趾）间关节粘连（SYM1）的错义突变c.1118T>G（p.L373R）改变了GDF5前结构域的一个高度保守的氨基酸，在GDF5组成结构中前结构域的功能目前尚不十分清楚。为了明确突变基因致病作用的方式和途径，本项目拟采用蛋白质免疫印记和氨基酸N端测序等方法检测p.L373R突变对前蛋白转化酶水解GDF5作用的影响；通过突变体克隆、基因转染、免疫组化和定量PCR等技术研究突变体诱导细胞分化的能力及涉及的信号分子，阐明突变导致肢端畸形的分子机制；利用显微注射、阿新蓝染色和原位杂交等技术比较突变对鸡胚肢体发育和对裸鼠受损关节软骨修复的影响，体内验证GDF5在鸡胚软骨/骨发育过程中的作用机制，同时也为人类组织工程学研究提供理论依据。

结论摘要：

生长分化因子5（Growth differentiation factor-5, GDF5），是调节软骨形成和骨骼发育的重要因子之一，近来受到广泛的关注。本课题组在对一中国汉族近端指(趾)骨间关节粘连（Proximal symphalangism, SYM1）家系的筛查中首次发现其致病突变GDF5c.1118T>G（p.L373R），该突变位于GDF5前体蛋白转化酶作用位点附近，在不同种属之间具有很高的保守性。为了明确GDF5-L373R突变的致病方式和途径，我们构建了多种表达载体，研究了野生型和突变型GDF5前体蛋白水解效率、成熟蛋白分泌表达量以及软骨/骨相关信号分子的改变。实验结果如下GDF5-L373R突变导致成熟GDF5蛋白分泌减少；同时在mRNA和蛋白水平上，检测到GDF5-L373R突变引起COLⅡ表达下调和ALP表达上调、p-smad1/5/8表达下调、smurf1表达上调和ID1表达下调；通过IP实验证实突变的GDF5-L373R与BMPR-1B的结合能力下调。上述研究结果提示，GDF5前结构域在成熟GDF5蛋白行使生物学功能中发挥了重要的作用，GDF5-L373R突变影响了前蛋白转化酶水解的效率以及蛋白的折叠、运输和加工等过程，导致成熟GDF5分泌减少，致使GDF5-L373R与BMPR-1B的结合能力下降，继而影响其下游软骨/骨发育相关因子水平，引起软骨分化能力降低或成骨分化能力增强而最终导致SYM1。本研究结果揭示了我们前期发现的GDF5-L373R致病新突变导致SYM1的可能机制，为下一步动物疾病模型的建立和深入研究GDF5蛋白前结构域的功能提供了重要的依据。