中文摘要：

前期工作研究发现，降钙素基因相关肽（CGRP）受体修饰蛋白-1（RAMP1）可增强CGRP抑制血管平滑肌细胞（VSMC）增殖作用。进一步研究CGRP受体重构对CGRP抑制氧化应激诱导VSMC增殖的信号跨膜转导途径具有重要的理论意义和科学价值。该项目拟应用血管紧张素II或H2O2建立氧化应激的VSMC增殖模型，观察CGRP受体组分蛋白RAMP1和受体成分蛋白（RCP）低表达或高表达时，CGRP对VSMC血管过氧化酶-1（VPO-1）表达或活性的影响；免疫共沉淀法和双分子荧光互补技术测定RAMP1或RCP和G蛋白相互作用对VPO-1表达的影响；激光共聚焦确定RAMP1或PCR蛋白信号复合物的亚细胞定位。通过研究CGRP受体重构对CGRP抗氧化应激抑制VSMC增殖的信号跨膜转导机制，可望提出CGRP受体重构概念，为进一步揭示G蛋白受体信号转导机制提供新思路，并为研制逆转血管重构药物提供新靶点。

结论摘要：

目的通过观察CGRP对细胞血管过氧化酶（VPO-1）和NADPH氧化酶（NOX1）表达的影响，探索CGRP对内源性活性氧自由基（ROS）所致的血管平滑肌细胞（VSMC） 增殖的作用信号通路；探索细胞膜caveolae及其蛋白caveolin-1在 CGRP受体重构及影响VPO-1表达信号转导通路中的作用。方法① VSMC来源于体外培养SD大鼠主动脉或从公司购买的鼠源性血管平滑肌细胞株( A10)。分别用小牛血清或AngⅡ、CGRP处理细胞，按实验要求和步骤分别加入各种信号激酶的拮抗剂，包括抗氧化剂( DPI)、β-环糊精（β-CD）、CGRP 拮抗剂( CGRP8-37)、p38MAPK 磷酸化抑制剂( SB203580)。②构建pCDNA3.1（+）-RAMP1真核表达载体并稳定转染至鼠源性血管平滑肌细胞株A10中，获得稳定高表达RAMP1的细胞系。③MTT、流式细胞术检测细胞增殖活力的变化; ④ Western Blot检测CGRP受体组分蛋白（CRLR、RCP及RAMP1）、ERK1/2、细胞分裂抗原（PCNA）、p38MAPK、Nox1 、VPO-1蛋白表达水平，PCR或qRT-PCR分别检测目的基因的mRNA表达水平。⑤免疫共沉淀（IP）检测相关蛋白质间的相互作用。⑥激光共聚焦显微镜或免疫荧光法分别检测CGRP受体各组分蛋白表达及细胞膜分布。⑦小RNA干扰技术检测目的基因对细胞的增殖的影响。结果①CGRP对VSMC在正常状态下的促生长作用和在病理增殖时的抑制作用可能与其通过调控p38MAPK 信号通路，控制ROS 含量来平衡VSMC 数量有关。CGRP也通过抑制p38 MAPK通路抑制外源性氧化剂H2O2诱导的Nox4 的表达，进而降低ROS的产生发挥保护内皮的作用。②高表达RAMP1能增强CGRP抑制AngⅡ诱导的血管平滑肌细胞增殖，其机制可能是通过RAMP1增加CRLR的膜分布，从而增强CGRP受体对CGRP的敏感性有关。③Caveolae结构的完整性不但影响CRLR的膜分布，也可以调控CGRP抑制VSMC增殖作用，其机制可能与CGRP调控Caveolin-1与CRLR或p-ERK1/2在Caveolae的结合有关。④ CGRP受体组分蛋白RCP可直接影响VPO-1的表达，在CGRP调节VPO-1活性的受体信号跨膜转导中起重要作用。