中文摘要：

氢酶具有催化产氢和催化吸氢的功能，但多数氢酶在体内和体外对氧极敏感的特性阻碍了其在制氢和燃料电池领域的研究和应用。了解氢酶结构与其氧稳定性关系，提高氢酶的氧稳定性，对促进氢能源的开发和利用具有重要意义。本课题组从温泉中分离到一株具有耐氧产氢特性的产酸克雷伯氏菌株，分析了该菌株全基因组序列，克隆和纯化了一种耐氧氢酶，研究了该氢酶的催化特性。本项目计划在此基础之上，对产酸克雷伯氏菌氢酶耐氧机理进行系统研究。通过突变技术分析该氢酶各亚基与其耐氧特性的关系；研究大亚基耐氧关键氨基酸位点；应用X-衍射技术对产酸克雷伯氏菌氢酶蛋白晶体三维结构及气体通道进行分析；分析蛋白分子表面修饰及固定化对氢酶气体逸散性及氧耐受性的影响；通过二维电泳及质谱分析技术研究与该氢酶体内氧保护相关的蛋白和基因；制作氢酶电极并研究该氢酶的氢氧化动力学。为该类氢酶在光解水产氢及燃料电池上的大规模应用提供理论依据。

结论摘要：

氢是一种清洁环保的优质能源。燃料电池是氢利用的重要环节，目前燃料电池存在寿命短、价格高等缺点，而氢酶是燃料电池较理想的催化剂。氢酶具有催化产氢和催化吸氢的功能，但多数氢酶在体内和体外对氧极敏感。因此了解氢酶氧稳定性与其结构的关系，提高氢酶氧稳定性，对促进氢能源的开发和利用具有重要意义。产酸克雷伯氏菌（K. oxytoca）HP1是一株具有耐氧产氢活性的菌株，该菌株氢酶具有较高的耐氧活性。本项目旨在对K. oxytoca HP1氢酶的氧耐受机理进行系统研究，在此基础上通过对关键氨基酸位点突变以获取高活性的耐氧氢酶。本研究计划主要内容包括通过某些氨基酸位点突变及突变氢酶的耐氧分析，推测产酸克雷伯氏菌氢酶大亚基与耐氧相关的关键氨基酸位点；建立该氢酶大亚基的三维结构模型；根据耐氧相关位点在三维结构模型上的位置，分析该氢酶的耐氧机理，并对该氢酶进行进一步的耐氧突变，构建高产氢活性的耐氧突变体；对该耐氧氢酶突变体开展应用研究。本项目严格按照任务书的内容执行，达到了预期成果。主要成果包括（1） 阐明了产酸克雷伯氏菌HP1氢酶大亚基（HycE）及小亚基（HycG）与其氧耐受性相关。（2）通过突变分析，确定了V125、V263、E340及M362是K. oxytoca HP1氢酶耐氧的重要关键位点。（3） 建立了K. oxytoca HP1氢酶大亚基三维结构，确定该氢酶大亚基耐氧关键氨位点的空间位置，V263、E340 及M362 位于KoHyd3 大亚基模型的分子表面，远离Ni-Fe活性中心；M362位于KoHyd3大亚基疏水通道的入口。构建了G300M及G300E（G300位于KoHyd3 大亚基气体通道入口）氢酶突变体并测试了氧耐受性，结果表明G300M突变体可显著增强KoHyd3氢酶的氧耐受性。该结果证实了氢酶分子表面气体通道入口处氨基酸的氧亲和性可显著影响其氧耐受性。此研究获得了一种改造氢酶氧耐受性的新方法。（4）通过突变分析，证实了将靠近活性中心的小亚基Fe-S Gly突变为Cys，可显著增强氢酶的耐氧特性。（5） 阐明了K. oxytoca HP1氢酶耐氧机理该氢酶耐氧能力的大小是由O2经气体通道进入活性中心的速率与结合于活性中心的氧化物被还原的速率共同决定。（6） 发表研究论文7篇，其中SCI论文5篇。