中文摘要：

基于树状抗原的多特异性抗体制备技术在小分子有机物免疫分析领域国内外未见报道。本项目以我国农产品中残留问题突出的有机磷、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯3大类农药中具有同类典型结构的对硫磷、异丙威和甲氰菊酯为对象，分别设计半抗原，进而利用树状分子合成同时携带上述3种农药半抗原的并联型和串联型树状抗原，通过动物免疫，制备抗血清，鉴定其抗原识别活性；通过杂交瘤技术制备多特异性单克隆抗体，采用酶联免疫吸附分析（ELISA）、荧光光谱（FS）、圆二色谱（CD）、软电离质谱（如ESI/CSI-MS）、等温滴定微量热（VP-ITC）等手段，分析多特异性抗体性能，研究比较并联、串联型树状抗原免疫应答效应及构效关系，探讨多特异性抗体与小分子农药相互作用机制。本研究不但为创新农药多残留分析方法奠定基础，而且为丰富小分子有机物多组分免疫检测技术手段提供新的依据。

结论摘要：

本项目以我国农产品中残留问题突出的不同结构系农药——对硫磷(PA)和氰戊菊酸(氰戊菊酯代谢物，FA)为模型，利用赖氨酸树状分子连接多个半抗原的方法，通过固相合成设计制备了针对二者的单/双簇树状抗原，通过动物免疫、杂交瘤技术、沉淀与亲和分离、免疫分析等过程，获得了天然双特异免疫抗体，并对其进行鉴定和特性分析，主要结果如下:(1)成功合成了PA和FA双蔟非树状/树状半抗原及其抗原；(2)水溶性良好的PA单簇0代树状抗原可有效改善特异性免疫应答效果(0-代树状抗原特异性抗体的效价72000显著高于其非树状抗原特异性抗体效价64000)；水溶性较差的FA树状抗原，因不能单分散在动物机体内有效接触细胞表面受体而难以获得较好的特异性免疫应答(效价小于1000)；(3)非树状双簇抗原FA-BSA-PA，免疫获得的抗体只能对PA这一种药物有识别，不能有效产生同时识别FA和PA的双特异性免疫应答；(4)树状抗原FA-Lys(PA)-BSA，免疫动物后成功获得了能同时识别FA和PA的高效价双特异性抗体(对FA和PA的IC50分别为209.95 ng/mL和42.45 ng/mL，线性范围分别为18.29-1079.10 ng/mL和7.02-563.01 ng/mL)；(5)上述结果表明:①基于赖氨酸的树状抗原在解决了良好水溶性或机体内单分散性条件下，可有效改善动物机体的特异性免疫应答效果，增强抗体特异性识别亲和力(效价)；②树状多簇抗原的决定簇被树状分子赖氨酸锚定于蛋白表面的比邻位置，两个决定簇能很好的产生比邻协同刺激细胞表面受体作用，从而产生具有双识别作用的高亲和力(效价)天然免疫双特异性抗体，其亲和力常数分别为Ka(PA)=8.576×10^8 L/mol，Ka(FA)=2.527×10^8 L/mol。本研究结果为制备天然免疫双特异性乃至多特异性抗体提供了新的思路。