中文摘要：

植物抗旱和抗冷冻的分子机制存在特异性和相似性，至今尚未见到用高抗干旱和冷冻两种逆境的典型抗逆植物对此进行研究的报道。蒙古沙冬青为内蒙古西部荒漠区唯一的常绿旱生阔叶灌木，具有很强的抗冻和抗旱性。本研究以其为模式植物，在构建其干旱和冷冻诱导表达SMART cDNA文库的基础上，对文库进行5`端测序和序列分析；然后用cDNA Macroarry技术分析两个文库的UniGene在干旱、冷冻和正常条件下的表达情况，比较在干旱和冷冻逆境下基因表达及其调控途径的异同，筛选响应两种逆境胁迫的共有基因和特有基因；再选择部分胁迫应答基因作为重要候选抗逆基因，测通其cDNA克隆的全序列，克隆其编码框cDNA并进行转基因功能验证，以获得关键抗逆基因。这项研究在国内外尚属首次，可为深入探讨植物抗旱和抗冷冻的分子机制提供理论依据，为高通量发掘相关抗逆基因提供研究平台，并为开展植物抗旱、抗冷冻基因工程提供重要后备基因。

结论摘要：

植物的抗寒抗旱性由多基因控制，目前有关其分子机制和抗逆基因研究已取得重要进展，但所用材料多数为拟南芥和水稻等非典型抗逆或不抗逆植物。蒙古沙冬青是内蒙古西部荒漠区唯一的常绿阔叶植物，具有很强的抗寒和抗旱特性。本研究以该植物为材料，在构建全长cDNA文库和转录组测序的基础上，利用RNA-Seq技术分析了其在冷冻和干旱胁迫下的表达谱，并对部分候选抗逆基因进行了功能验证。冷冻和干旱胁迫文库的滴度分别为9.4×106和1.6×107 pfu /mL，重组率分别为98.3%和97.7%，插入片段长度多数接近1 kb。对近3500个克隆进行测序获得1500多条Unigene序列，其中900多条可在Nr等数据库中注释。利用Illumina技术进行转录组测序，获得47.3M Clean reads和8.6万条Unigene序列。其平均长度为756 nt，N50值为1279 nt。在Nr和TIGR Plant Transcript Assemblies等数据库中进行Blast搜索，有近5万条序列可获得功能注释，归属于44个GO Classes和125个KEGG pathways，在所有植物中与大豆序列相似性最高。通过表达谱分析，从冷冻和干旱胁迫不同时期分别筛选到大约4千和5千个差异表达基因 (DEGs），其中响应两种胁迫的共有和特有基因各占大约一半。许多DEGs与已知的胁迫应答基因或抗逆基因具有同源性。对不同胁迫处理时期DEGs的交集进行表达模式聚类分析，发现绝大多数DEGs在胁迫处理期间表现为上调或下调两种表达模式。GO功能和KEGG pathway显著性富集分析表明，受两种胁迫共同调节的DEGs主要参与次生代谢物质合成、防御反应和脂肪酸及有机酸生物合成，而特有DEGs彼此不同冷冻应答DEGs与氨基聚糖分解、脂类定位和质体及叶绿体关系密切，干旱应答DEGs则在小分子物质和有机酸生物合成及膜系统中起独特作用。利用RT-PCR方法克隆到7个候选抗逆基因的编码区cDNA，将其在拟南芥中超表达或诱导表达，证明其中3个基因，即AmDREB2、AmRD22和AmCAT可显著提高转基因株系的耐旱和/或耐盐性。本项目为揭示蒙古沙冬青抗寒抗旱性分子机理以及二者间的相似性和特异性提供了重要依据，为高通量发掘相关抗逆基因奠定了良好基础，为深入理解植物抗寒抗旱性分子机理提供了新知识。